磷脂的极端复杂性和低丰度问题使其可靠的分离带来了一定的困难，进一步深入研究其生物学功能，磷脂仍然是一个重要研究目标。早期的磷脂分析方法常采用络合光度法和比色法对磷脂总量进行检测和质量分析，该方法不能实现单一组分的分析检测。近年来，薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS）等新型分离分析技术用于磷脂的分离分析研究。

TLC是最早应用于磷脂分离分析的一种方法，由于具有操作简便和样品处理量大等优势特点一直使用至今。TLC的主要缺点是其仅对同一类别的磷脂具有分离效果，无法对单一类别磷脂中分子种属进行分离分析。在TLC分析过程中，磷脂分子完全暴露在空气中，会导致部分不饱和脂肪酸氧化，使结果产生偏差。

HPLC是近年来广泛采用的磷脂分离分析技术，这种分离分析技术能够实现对不同类别和种属关系磷脂的分离，进而对复杂磷脂具有很好的分离效果。在HPLC分离磷脂时，对于不同类的磷脂多采用正相色谱（NPLC）；对于同一类不同种属关系的磷脂往往采用反相色谱（RPLC）进行分离。随着HPLC技术的不断发展，二维高效液相色谱在磷脂的分离分析中的优势越来越明显，可以通过色谱柱的选择对磷脂的分子类别和种属实现双重分离。例如，Zhang等建立了一种离线二维混合模式结合反相高效液相色谱法分析复杂样品中脂质的方法。在第一维色谱中，按照中性脂类到极性脂类的洗脱顺序，22种不同的脂类可成功被硅胶色谱柱分离；在第二维色谱中，根据脂酰基链的长度和不饱和程度，采用反相C30色谱柱分离，从而进一步提高了分离效率。

HPLC虽然是目前最常采用的磷脂分离技术，但对于磷脂的定性鉴别还存在较大的困难。HPLC与MS联用技术是目前磷脂鉴定最常用的技术，电喷雾电离技术（ESI）是磷脂质谱分析中最常用的离子源。HPLC-ESI-MS技术联用可以有效降低复杂样品中基质的干扰，提高磷脂的定性鉴别能力。例如，Kim等利用二醇基正相色谱柱建立了NPLC-ESI-MS定量和定性分析新方法，可从大鼠心脏和骨骼肌线粒体中检测到7类磷脂，包括PE、PC、PA、PI、PS、心磷脂（CL）和单溶血心磷脂（MLCL），并对除PS以外的所有磷脂进行定量分析，显示出良好的重现性和准确性。

1.1.4 磷脂分离分析的难点

首先，磷脂在细胞功能中发挥着细胞屏障、信号传递和能量库等多种功能，细胞脂质非常复杂，有着数以百计的分子物种。细胞脂质在生命活动中也是高度动态的，细胞膜将细胞彼此分离，包围细胞器，并将细胞器细分成更小的隔间。以这种方式，细胞膜在细胞内产生了许多不同的环境，这些环境中发生着不同的生化反应，因此细胞脂质随着细胞所处的环境不断发生着变化。最后，磷脂分子具有多种多样的异构体，这进一步增加了磷脂分离鉴定的挑战性。如图所示，以PC（36:1）为例介绍磷脂可能存在的异构体。PC存在的主要异构体形式包括sn位置同分异构体、双键位置异构体、双键顺反同分异构体和R/S手性对映体。此外，生物样品中磷脂成分复杂、种类多样且含量极低以及磷脂结构中很少存在易电离基团等特性使得磷脂的定量分析存在困难。利用衍生化技术对磷脂进行后修饰，可提高磷脂的离子化效率，使得定量分析效率提高。