主题:【第十六届原创】以肝癌组织单外泌体表面蛋白组为基础的肝癌预后模型构建

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以肝癌组织单外泌体表面蛋白组为基础的肝癌预后模型构建



1、

研究内容

从肝细胞肝癌和癌旁组织中提取外泌体,深入探讨肝癌组织外泌体和癌旁组织外泌体的差异,通过生物信息学手段发现关键分子,并通过实验验证关键分子的作用,结合临床信息构建肝癌预后模型,具体研究内容为:

1)临床样本收集:收集肝细胞肝癌和癌旁组织20例,分别提取外泌体;后期验证收集肝细胞肝癌和癌旁组织80例。

2)外泌体表面蛋白测定及关键分子检测:前期采?邻近编码技术(Proximity Barcoding Assay, PBA)对单外泌体进行分析,对样本中的外泌体进行高通量、单颗粒、多种蛋白的检测;miRNA组学分析:与疾病发生相关的外泌体源功能分子;差异分子的功能、通路的富集与注释;组织外泌体验证关键分子;关键分子上下游通路预测、功能富集、表型预测;



3)功能机制研究:获得或缺失关键分子后的外泌体处理肿瘤细胞,检测干性表型;体内实验验证其对小鼠成瘤的影响。

1、 研究方案:

1.研究方案(有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明,项目可行性分析)

研究方法

(1)临床样本收集:收集肝细胞肝癌和癌旁组织20例,分别提取外泌体;

(2)外泌体表面蛋白测定及关键分子检测:前期采用邻近编码技术(Proximity Barcoding Assay, PBA)对单外泌体进行分析,对样本中的外泌体进行高通量、单颗粒、多种蛋白的检测;miRNA组学分析:与疾病发生相关的外泌体源功能分子;差异分子的功能、通路的富集与注释;组织外泌体验证关键分子;关键分子上下游通路预测、功能富集、表型预测

(3)功能机制研究:获得或缺失关键分子后的外泌体处理肿瘤细胞,检测干性表型;体内实验验证其对小鼠成瘤的影响;

4)预后模型的构建:将临床信息与关键分子信息相结合,构建肝癌预后模型。

实验方案

一、组织外泌体的提取

1.组织切片解离,获得外泌体悬液

1)冰冻切片机对组织进行切片处理,

2)将提前配好的消化酶转移到50 ml的离心管中。

3装有切片组织的离心管转移至于37℃水浴锅中水浴孵育 10-15 min,过程每隔 5 min充分混合一次观察组织形态消化情况。

437℃孵育结束后将组织消化混合液放置在冰上,用70 μm滤膜过滤上述溶液到新的15 ml的离心管中。

5)向每个15 ml的离心管中加入 25 ul 蛋白酶和磷酸酶抑制剂1:100

2.外泌体悬液差速离心

14℃300×g,离心 10 min,转移上清到新的 15 ml 离心管中。

24℃2000×g,离心 10 min,转移上清到新的 15 ml 离心管中。

34℃10, 000×g,离心 20 min,上清转移到新的 15 ml 离心管中。

4)步骤(3)得到的上清液用 10 ml 注射器通过 0.22 μm 滤膜过滤进入大超离管中。

54℃150,000 ×g,超离2 h

6)超离结束后,弃上清,沉淀以0.4 ml+0.4 ml遇冷的PBS(含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)溶解后,获得小囊泡。

3. SEC 排阻+超滤

1)将超离后1 mlPBS洗涤的外泌体加入到排阻柱中,待液面下降至上筛板时,依次加入PBS,并同时

2)收集对应馏分加入 100kd 超滤管中。

34℃4000×g,离心 1min

4)超滤至合适体积后,对着滤膜反复吹打,吸出200 ul后进行BCA蛋白浓度检测。

4. BCA检测

将超滤得到的外泌体进行BCA蛋白浓度检测。

二、外泌体表面蛋白及miRNA组学分析

1. 与疾病发生相关的外泌体源功能分子,差异分子的功能、通路的富集和注释。

2. 组织外泌体验证关键分子,供体细胞的推断。

3. 关键分子上下游通路预测,功能富集,表型预测。

4. 预后模型的构建:将临床信息与关键分子信息相结合,构建肝癌预后模型。

三、功能机制研究

1. 获得或缺失关键分子后的外泌体处理肿瘤细胞,检测干性表型。

2. 体内实验验证其对小鼠成瘤的影响:经溯源分析得出不同亚群外泌体的来源,将特定来源的外泌体注入小鼠体内,研究其对小鼠成瘤的影响。

可行性分析

本课题组前期进行了外泌体提取的相关研究,已取得学术成果。

1)科研基础扎实:申请者研究团队从事相关基础研究多年,近年在国内外期刊上发表论文多篇,具备高质量完成项目的能力。

2)研究目标切实:本课题密切联系外泌体研究现状,旨在研究组织外泌体与疾病关系,并为疾病的诊断和治疗提供切实合理的方案。

3)技术平台与硬件设施完善:申请者所在单位的分子生物学及生物信息学各项研究方法比较成熟,具备完成实验所需的全套设备,并且已熟练掌握上述技术路线涉及的各种实验方法。

4)项目组成员近年来连续从事外泌体捕获及分离方法研究,熟悉该研究领域的动态前沿,有一定的研究功底。

5)本项目的研究团队人员配置合理,骨干成员均为年富力强的中青年科学工作者和技术骨干,有较强科研履约能力和良好履约记录。

创新点:

目前对于外泌体的研究大多局限于体液外泌体,体液来源的外泌体在疾病研究和早诊方面存在一定的局限性。首先,体液外泌体来源于机体内的各种细胞、组织导致其组成复杂,鉴定出的标志物是否为肿瘤所特异并无清晰阐述。其次,组织微环境中包括肿瘤细胞和其他各种细胞的复杂作用。本研究直接从组织中提取的外泌体(Ti-EVs具有组织特异性、准确反映组织微环境以及携带更丰富的信息等优点。
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