主题:【第十六届原创】富集O-GlcNAc糖肽新平台研究基础

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富集O-GlcNAc糖肽新平台研究基础



在基于化学酶促反应-可逆羟胺富集O-GlcNAc糖肽的方法开发方面,已经初步建立了新的步法标记富集O-GlcNAc糖肽新平台,具体阐述如下:

基于化学酶促反应标记-可逆羟胺富集的原理,设计了整体实验流程,将简单或复杂的样本进行提蛋白、酶解、切糖、转糖等前处理步骤,用羟胺材料进行可逆富集,将洗脱样品进行质谱检测分析。(图一)

 

1. 转接Gal-ketone羟胺材料富集O-GlcNAc糖肽实验流程



在羟胺材料制备及表征方面,与郭志谋老师合作,在硅胶材料上键和上烯丙基羟胺小分子,合成羟胺材料,巯基硅胶碳含量为5.32%,氮含量为0.1%SOA填料碳含量为6.33%,氮含量为0.41%。表结果为5um硅胶的比表面积为337m2/g,键和密度为0.85umol/m2。(图2



图2. 羟胺材料的制备与表征




在标肽层次进行UDP-糖的筛选、转糖、富集、释放可行性的考察,本研究通过合成更高效的UDP-糖,提高转糖效率。(图3)我们分别选用了文献中报道过的UDP-GalNAz, UDP-GalNAc以及本研究中的UDP-GalNAc标肽中进行转糖活性验证。并对合成的UDP-O-GlcNAc转接Gal-ketone反应条件进行了优化,目前30℃条件下5-6小时即可达到很高的反应效率,一般转接Gal或者GalNAc实验需要4℃条件下反应20小时,相比之下转糖时间大幅缩短,大大提高了转糖效率。使用烯丙基羟胺材料对转糖标肽P2NNLEES*(O-GlcNAc)LLKLE)进行富集,在只有转糖标肽和未转糖标肽存在的情况下,富集反应4小时即可反应完全。释放条件优化方面,目前500mM甲氧羟胺/50mM醋酸钠/1%苯胺可以达到很好的释放效果。





     

图3. 标肽层次对方法可行性的验证



对标肽层次转化效率以及选择性进行分析,测试了三条带有O-GlcNAc修饰的肽段(SGP1NNLEES(GlcNAc)LLKLESGP2SVES(GlcNAc)GSVDVKSGP3TAPTS(GlcNAc)TIAPG)转接酮糖后与烯丙基羟胺、甲氧羟胺的反应活性。同时运用BSA干扰实验在标肽层次对结果表明在糖肽:BSA=1:1000的条件下也可以将糖肽很好的富集出来,并且特异性较高。(图4



图4. 标肽层次对转化效率及特异性考察



进而使用HeLa细胞核进行转糖富集实验条件优化,用Tip洗涤材料并在一定程度上减少材料用量可以降低非特异性吸附,目前实验结果在pH=5.0条件下,400微克肽段对应2mg富集材料的效果最好,使用这个条件对HeLa细胞全肽进行富集,400微克HeLa细胞全肽可富集1080O-GlcNAc肽段,氨基酸顺序大于3844处潜在修饰位点中只有31处位于NXS/T序列,与天冬酰胺在蛋白质中的频率基本相符,提示本方法不引入此类假阳性干扰。对鉴定到的O-GlcNAc修饰糖肽进行GO分析,对蛋白参与的生物学过程、细胞定位及分子功能进行研究。(图5



图5. Hela细胞全肽O-GlcNAc糖基化水平及GO分析



以上工作在简单标肽样品及复杂样品:Hela细胞核肽及细胞全肽样品层次均证实了方法的可行性,实现了对O-GlcNAc糖肽的一步标记,一步富集,通过优化转糖、富集步骤,大大提高了O-GlcNAc糖肽的鉴定数量,为该方法应用于后续对O-GlcNAc水平调控相分离的研究提供了可靠的技术支持。
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