O-GlcNAc糖肽富集在研究O-GlcNAc水平对相分离调控机制研究中的应用

研究内容：

由于O-GlcNAc糖基化具有修饰丰度低，高度动态变化等特点，常用的O-GlcNAc糖基化富集方法难以实现对其简单高效高特异性的富集，基于亲和作用的直接捕捉方法操作简便，但特异性差；通过非天然糖基的代谢标记法或化学酶促标记法富集O-GlcNAc糖肽由于标签过大，影响糖肽的鉴定效率；通过转糖氧化引入醛基进行酰肼富集的策略步骤繁琐，基于以上理论基础，本项目拟开发一种新型的基于化学酶衍生的羟胺材料富集O-GlcNAc糖肽的新方法，通过一些列UDP-糖的筛选、转糖、富集、释放等步骤得到O-GlcNAc糖肽富集样品，最后进行质谱分析。实现一步标记富集，高特异性富集O-GlcNAc糖肽的目的。

具体研究内容包括以下几个方面：

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目前现有的非共价作用富集法的亲和力和特异性通常较低，难以提高O-GlcNAc鉴定的覆盖度；以化学酶促标记法为代表的共价作用富集策略，显著提高了糖肽富集的特异性，然而引入大质量标签会降低糖肽的鉴定效率，因此，发展O-GlcNAc糖肽的‘无损’成为其高特异性富集、高覆盖度鉴定的关键。

首先在标肽层次进行方法可行性的验证：选用三条带有O-GlcNAc修饰的肽段（SGP1：NNLEES(GlcNAc)LLKLE；SGP2：SVES(GlcNAc)GSVDVK；SGP3：TAPTS(GlcNAc)TIAPG）转接酮糖后与烯丙基羟胺、甲氧羟胺可逆反应，并采用硅胶键合烯丙基羟胺小分子的羟胺富集材料对带有酮羰基的O-GlcNAc糖肽在酸性条件下进行富集，MALDI数据显示转糖、富集以及释放均成功进行，实现了在标肽层次对O-GlcNAc糖肽的成功富集。

为验证该方法的特异性，在标肽层次按1：100/1：1000/1：10000的比例加入BSA，考察在BSA干扰情况下该方法的富集效果，MALDI数据显示在目标肽段与BSA比例在1：10000条件下，仍能特异性的富集到带有酮基糖肽，验证了方法的可行性及高特异性。

2）O-GlcNAc糖肽富集新方法在Hela细胞全肽层次验证

为验证该方法的普适性，在Hela细胞核肽及全肽层次进行实验，运用合成的带有烯丙基羟胺小分子的硅胶材料对生物样本中的O-GlcNAc糖肽进行富集，通过优化富集、洗涤条件提高方法的灵敏度、特异性和覆盖度，在复杂体系中实现对O-GlcNAc糖肽富集新方法的验证。

3）O-GlcNAc糖肽富集新方法在研究O-GlcNAc水平对相分离调控机制研究中的应用

相分离是近年来研究的热点，已有研究表明相分离在细胞中普遍存在，与基因组的组装、转录调控可能密切相关，相分离的失调可能是一些疾病（如神经/肌肉退行性疾病）发生的病因，相关领域的科学家也开始通过相分离这个视角重新审视相关疾病，通过干扰异常“相分离”来达到治疗相关疾病的目的。随着相分离的研究逐渐增多，研究人员发现相分离在无膜器官的形成，信号转导、细胞骨架、超分子组装、基因的激活等扮演着功能，相分离异常可能导致疾病，如神经退行性疾病、肿瘤、衰老等。关于糖基化水平与相分离关系的研究尚处于初步阶段，相分离与O-GlcNAc修饰之间的关系仍不明确，O-GlcNAc是否与相分离的调控有关，又是如何进行调控的仍需要简单快速高效的O-GlcNAc糖肽富集策略进行辅助研究。

本课题尝试应用新开发的O-GlcNAc糖肽富集策略对相分离前后Hela细胞全蛋白的O-GlcNAc水平进行系统分析，通过比较差异蛋白研究O-GlcNAc修饰对相分离的影响，为解释相分离的本质提供基础。

具体实验内容如下：

1）化学酶促标记-羟胺可逆富集O-GlcNAc糖肽新方法的确立

选用三条带有O-GlcNAc修饰的肽段（SGP1：NNLEES(GlcNAc)LLKLE；SGP2：SVES(GlcNAc)GSVDVK；SGP3：TAPTS(GlcNAc)TIAPG），在体系中加入45 ul ddH2O、40 ul 0.125 ug/ul P1/2/3标肽溶液、80 ul 标记溶液、15 ul 100 mM MnCl2（pH 3.0）、30ul UDP-Gal-ketone（0.5 mM，溶于10 mM HEPES）、32 ul 0.83 ug/ul GalT1（Y289L）在30℃条件下反应5-6 h用MALDI检测其转糖效率反应效率，剩余样品加入2 ul TFA酸化，200 ul Tip除盐后进行分装冻干，冻干样品使用烯丙基羟胺材料对转糖标肽进行富集，在只有转糖标肽和未转糖标肽存在的情况下，富集反应4小时即可反应完全。对释放条件进行优化，500 mM甲氧羟胺/50 mM醋酸钠/1%苯胺可以达到很好的释放效果。BSA干扰实验结果表明在糖肽：BSA=1:1000的条件下也可以将糖肽很好的富集出来，并且特异性较高。

2）O-GlcNAc糖肽富集新方法在Hela细胞全肽层次验证

Hela细胞长至80%满，PBS洗涤两次，冰上刮取细胞，用400 ul 4%SDS进行超声破碎，得到澄清蛋白溶液，取400 ug蛋白加入80 ul 10 mM的HEPES（aq，pH 7.9）、98 ul ddH2O、160 ul标记用液（125 mM NaCl/50 mM HEPES，pH 7.9）和22 ul 100 mM MnCl2（aq，pH 3.0）混匀，再加入40 ul 0.5 mM UDP-Gal酮糖母液和60 ul 0.83 ug/ul GalT1-Y289L酶混匀，30℃反应7h后冷却到室温并加入终浓度为1%的TFA（4.6 ul）混匀，使用商品化的30 mg C18 SPE柱除盐，冻干洗脱液；将冻干的转糖产物用200 ul 标准PBS（pH 7.4）冰浴超声1 min复溶，加入标准PBS（pH 5.0）洗涤一次的烯丙基羟胺材料中25℃，1200 rpm孵育8h。

洗涤材料：分别用300ul 8M尿素、1.5 M NaCl、80%ACN和100mM NH4HCO3洗涤3次（离心3000g，3 min，注射器移走上清），50mM醋酸钠洗涤一次，加入200ul释放液（0.5M甲氧羟胺/50mM醋酸钠，pH 4.5），加入1%体积苯胺，25℃，1200rpm震荡8h以上，取上清液加入终浓度为1%的TFA混匀，用自制的2mg C18 Tip除盐。

2.3技术路线

该研究的总体研究方案如图1所示：