O-GlcNAc糖肽富集在研究O-GlcNAc水平对相分离调控机制研究中的应用 研究内容: 由于O-GlcNAc糖基化具有修饰丰度低,高度动态变化等特点,常用的O-GlcNAc糖基化富集方法难以实现对其简单高效高特异性的富集,基于亲和作用的直接捕捉方法操作简便,但特异性差;通过非天然糖基的代谢标记法或化学酶促标记法富集O-GlcNAc糖肽由于标签过大,影响糖肽的鉴定效率;通过转糖氧化引入醛基进行酰肼富集的策略步骤繁琐,基于以上理论基础,本项目拟开发一种新型的基于化学酶衍生的羟胺材料富集O-GlcNAc糖肽的新方法,通过一些列UDP-糖的筛选、转糖、富集、释放等步骤得到O-GlcNAc糖肽富集样品,最后进行质谱分析。实现一步标记富集,高特异性富集O-GlcNAc糖肽的目的。 具体研究内容包括以下几个方面: 1 目前现有的非共价作用富集法的亲和力和特异性通常较低,难以提高O-GlcNAc鉴定的覆盖度;以化学酶促标记法为代表的共价作用富集策略,显著提高了糖肽富集的特异性,然而引入大质量标签会降低糖肽的鉴定效率,因此,发展O-GlcNAc糖肽的‘无损’成为其高特异性富集、高覆盖度鉴定的关键。 首先在标肽层次进行方法可行性的验证:选用三条带有O-GlcNAc修饰的肽段(SGP1:NNLEES(GlcNAc)LLKLE;SGP2:SVES(GlcNAc)GSVDVK;SGP3:TAPTS(GlcNAc)TIAPG)转接酮糖后与烯丙基羟胺、甲氧羟胺可逆反应,并采用硅胶键合烯丙基羟胺小分子的羟胺富集材料对带有酮羰基的O-GlcNAc糖肽在酸性条件下进行富集,MALDI数据显示转糖、富集以及释放均成功进行,实现了在标肽层次对O-GlcNAc糖肽的成功富集。 为验证该方法的特异性,在标肽层次按1:100/1:1000/1:10000的比例加入BSA,考察在BSA干扰情况下该方法的富集效果,MALDI数据显示在目标肽段与BSA比例在1:10000条件下,仍能特异性的富集到带有酮基糖肽,验证了方法的可行性及高特异性。 2)O-GlcNAc糖肽富集新方法在Hela细胞全肽层次验证 为验证该方法的普适性,在Hela细胞核肽及全肽层次进行实验,运用合成的带有烯丙基羟胺小分子的硅胶材料对生物样本中的O-GlcNAc糖肽进行富集,通过优化富集、洗涤条件提高方法的灵敏度、特异性和覆盖度,在复杂体系中实现对O-GlcNAc糖肽富集新方法的验证。 3)O-GlcNAc糖肽富集新方法在研究O-GlcNAc水平对相分离调控机制研究中的应用 相分离是近年来研究的热点,已有研究表明相分离在细胞中普遍存在,与基因组的组装、转录调控可能密切相关,相分离的失调可能是一些疾病(如神经/肌肉退行性疾病)发生的病因,相关领域的科学家也开始通过相分离这个视角重新审视相关疾病,通过干扰异常“相分离”来达到治疗相关疾病的目的。随着相分离的研究逐渐增多,研究人员发现相分离在无膜器官的形成 ,信号转导、细胞骨架、超分子组装、基因的激活等扮演着功能,相分离异常可能导致疾病,如神经退行性疾病、肿瘤、衰老等。关于糖基化水平与相分离关系的研究尚处于初步阶段,相分离与O-GlcNAc修饰之间的关系仍不明确,O-GlcNAc是否与相分离的调控有关,又是如何进行调控的仍需要简单快速高效的O-GlcNAc糖肽富集策略进行辅助研究。 本课题尝试应用新开发的O-GlcNAc糖肽富集策略对相分离前后Hela细胞全蛋白的O-GlcNAc水平进行系统分析,通过比较差异蛋白研究O-GlcNAc修饰对相分离的影响,为解释相分离的本质提供基础。 具体实验内容如下: 1)化学酶促标记-羟胺可逆富集O-GlcNAc糖肽新方法的确立 选用三条带有O-GlcNAc修饰的肽段(SGP1:NNLEES(GlcNAc)LLKLE;SGP2:SVES(GlcNAc)GSVDVK;SGP3:TAPTS(GlcNAc)TIAPG),在体系中加入45 ul ddH2O、40 ul 0.125 ug/ul P1/2/3标肽溶液、80 ul 标记溶液、15 ul 100 mM MnCl2(pH 3.0)、30ul UDP-Gal-ketone(0.5 mM,溶于10 mM HEPES)、32 ul 0.83 ug/ul GalT1(Y289L)在30℃条件下反应5-6 h用MALDI检测其转糖效率反应效率,剩余样品加入2 ul TFA酸化,200 ul Tip除盐后进行分装冻干,冻干样品使用烯丙基羟胺材料对转糖标肽进行富集,在只有转糖标肽和未转糖标肽存在的情况下,富集反应4小时即可反应完全。对释放条件进行优化,500 mM甲氧羟胺/50 mM醋酸钠/1%苯胺可以达到很好的释放效果。BSA干扰实验结果表明在糖肽:BSA=1:1000的条件下也可以将糖肽很好的富集出来,并且特异性较高。 2)O-GlcNAc糖肽富集新方法在Hela细胞全肽层次验证 Hela细胞长至80%满,PBS洗涤两次,冰上刮取细胞,用400 ul 4%SDS进行超声破碎,得到澄清蛋白溶液,取400 ug蛋白加入80 ul 10 mM的HEPES(aq,pH 7.9)、98 ul ddH2O、160 ul标记用液(125 mM NaCl/50 mM HEPES,pH 7.9)和22 ul 100 mM MnCl2(aq,pH 3.0)混匀,再加入40 ul 0.5 mM UDP-Gal酮糖母液和60 ul 0.83 ug/ul GalT1-Y289L酶混匀,30℃反应7h后冷却到室温并加入终浓度为1%的TFA(4.6 ul)混匀,使用商品化的30 mg C18 SPE柱除盐,冻干洗脱液;将冻干的转糖产物用200 ul 标准PBS(pH 7.4)冰浴超声1 min复溶,加入标准PBS(pH 5.0)洗涤一次的烯丙基羟胺材料中25℃,1200 rpm孵育8h。 洗涤材料:分别用300ul 8M尿素、1.5 M NaCl、80%ACN和100mM NH4HCO3洗涤3次(离心3000g,3 min,注射器移走上清),50mM醋酸钠洗涤一次,加入200ul释放液(0.5M甲氧羟胺/50mM醋酸钠,pH 4.5),加入1%体积苯胺,25℃,1200rpm震荡8h以上,取上清液加入终浓度为1%的TFA混匀,用自制的2mg C18 Tip除盐。 2.3技术路线 该研究的总体研究方案如图1所示: 图1 总体研究方案:(A)基于化学酶促标记-可逆羟胺富集O-GlcNAc糖肽新方法的开发;(B)相分离与O-GlcNAc修饰水平调控机制的研究 |