随着生物技术的不断发展，由于多肽药物适应证广，安全性高、用量少且疗效显著，多肽药物目前在临床上的应用越来越广泛，相应的质量研究也越来越深入。多肽药物是由多个氨基酸通过肽键链接而形成的一类化合物，由于分子量大，结构相对复杂，活性位点多，结构稳定性相对较差，随着产品的放置，容易产生降解，形成聚合物，由于极性相近，反向色谱法很难将其有效分离，定量检测。结合聚合物分子量大小不同的特点，采用分子排阻法进行聚合物的分离，参照《中国药典》2020 年版四部及其相关资料，建立了十二肽化合物中聚合物的检测方法，通过该方法控制聚合物

杂质的量来保证产品质量。

1 实验材料

1.1 仪器信息

Waters 2695-2487 型高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司）；MSA225S-1CE-DU 型电子分析天平

（德国赛多利斯公司）；NBL-214i 电子天平（艾德姆衡器武汉有限公司）

1.2 试剂与试药信息

十二肽对照品（批号：D20201101，纯度：86.7%）；Dimer 聚合物对照品（批号：D20200529，纯度：81.8%）；磷酸二氢钠（色谱纯）批号：20200316，厂家：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水硫酸钠（色谱纯）批号：20200110，厂家：天津市科密欧化学试剂有限公司；十二水合磷酸氢二钠（色谱纯）批号：20200143，厂家：天津市科密欧化学试剂有限公司。

2 试验方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱：BioCore SEC-150 5μm，7.8×300mm 纳谱分析技术（苏州）有限公司；

流动相：含磷酸二氢钠 0.05 mol/L、磷酸氢二钠 0.05 mol/L、硫酸钠 0.1 mol/L 的混合溶液；洗脱方式：等度洗脱；

流速：0.5 mL/min；检测波长：274 nm；柱温：30 ℃；

进样量：10 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 系统适用性溶液的配制

取十二肽对照品、Dimer 聚合物对照品适量，加流动相溶解，制成每 1 mL 中含十二肽约 2.0 mg 和

Dimer 聚合物约为 0.2 mg 的混合溶液，作为系统适用性溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制

取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每 1 mL约含 2 mg 的溶液，作为供试品溶液。

2.2.3 对照溶液的配制

精密量取供试品溶液 1 mL，用流动相定容至 100 mL，混匀，作为对照溶液。

2.3. 方法学验证

2.3.1 仪器精密度

取 “2.2.1”项下系统适用性溶液，采用“2.1”项下的色谱条件，连续进样 6 次，考察各峰保留时间和峰面积的 RSD。系统适用性中各峰保留时间的 RSD≤1.0%，峰面积的 RSD≤2.0%，表明该方法仪器精密度良好。仪器精密度结果见表 1，图谱见图 1。

表 1 仪器精密度检测结果

名称	主成分		Dimer 聚合物
仪器精密度	保留时间（min）	峰面积（mAu*min）	保留时间（min）	峰面积（mAu*min）
系统适用性溶液 1	23.838	2715042	22.058	228285
系统适用性溶液 2	23.837	2714873	22.063	226972
系统适用性溶液 3	23.835	2709066	22.065	226038
系统适用性溶液 4	23.836	2707598	22.071	226798
系统适用性溶液 5	23.838	2709442	22.079	225603
系统适用性溶液 6	23.841	2703447	22.086	224641
RSD（%）	0.1	0.2	0.1	0.6

图 1 仪器精密度重复进样 6 针

2.3.2 专属性

2.3.2.1 专属性溶液的配制空白溶剂：流动相。

十二肽对照品溶液：称取对照品适量，加流动相溶解并稀释至2 mg/mL的溶液。

Dimer 聚合物溶液：称取 Dimer 聚合物对照品适量，加流动相溶解并定容至 10 mL，再取 1 mL，加流动相定容至 5 mL，混匀。

系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液配制同“2.2 溶液制备”项下。

2.3.2.2 结果分析

空白溶剂对主峰及 Dimer 聚合物检出均无干扰，主峰与 Dimer 聚合物分离度大于 2.0，理论塔板数

按十二肽主峰计算大于 30000，各峰纯度均大于 980，专属性良好。代表性图谱详见图 2~图 4。

图 2 空白溶剂

图 3 Dimer 聚合物杂质定位

图 4 系统适用性试验

2.3.3 检测限与定量限

Dimer 聚合物检测限为 19 ng，定量限为 40 ng，6 个定量限重复性溶液中保留时间的 RSD 为

0.09%，小于 1.0%，6 个峰面积的 RSD 为 5.73，小于 8.0%，均符合要求。结果详见表 2。

表 2 定量限与检测线检测结果

信噪比（S/N）	10		定量限		40 ng
信噪比（S/N）	3		检测限		19 ng
定量限重复性
名称	1	2	3	4	5	6	RSD（%）
保留时间（min）	22.613	22.601	22.598	22.577	22.571	22.558	0.09
峰面积（mAu*min）	2571	2238	2358	2325	2191	2405	5.73

2.3.4 线性与范围

在定量限～限度值的 150%范围内，配制 6 份不同浓度溶液，进行线性测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析。

配制十二肽和 Dimer 聚合物线性溶液（线性溶液 1（定量限）、线性溶液 2（50%）、线性溶液 3

（80%）、线性溶液 4（100%）、线性溶液 5（120%）、线性溶液 6（150%））试验，十二肽及Dimer 聚合物的线性相关系数 r≥0.990，截距均在 100%响应值的 25%以内，说明此范围内十二肽和Dimer 聚合物的线性关系良好。验证结果见表 3。

表 3 线性与范围检测结果

十二肽
线性系列	线性-1	线性-2	线性-3	线性-4	线性-5	线性-6
X(浓度 μg/ml)	1.540	5.133	8.213	10.27	12.32	15.40

Y（峰面积μV*s）	3309	7785	12058	15112	18371	23189
曲线	y=1438.69x+625.70				R 值	0.999
100%响应值的 25%	3753.15				截距	625.70
Dimer 聚合物
线性系列	线性-1	线性-2	线性-3	线性-4	线性-5	线性-6
X(浓度 μg/ml)	4.005	5.006	8.010	10.01	12.01	15.02
Y（峰面积μV*s）	3243	4296	7403	8860	10308	13690
曲线	y=920.71x–329.90		R 值	0.998	截距	329.90
100%响应值的 25%	2219.29

2.3.5 重复性

照“2.2.2 和 2.2.3”项下方法平行配制 6 份供试品溶液和对照溶液，均采用自身对照法进行计算结果。6 个供试品中Dimer 聚合物含量的RSD≤6.0%，说明该方法重复性良好。

2.3.6 溶液稳定性

照“2.2.2 和 2.2.3”项下方法平行配制 6 份供试品溶液和对照溶液，置于室温环境中，每隔 2 小时取样检测，考察 24 小时。结果显示两种放置条件下，对照溶液峰面积 RSD%≤6.0%；Dimer 聚合物含量的 RSD%≤6%，说明本品的供试品溶液和对照溶液在室温条件下放置 24h 稳定性良好。验证结果见表 4。

表 4 溶液稳定性考察结果

时间（h）	对照溶液峰面积	Dimer 聚合物（%）
0	18117	0.42
2	18049	0.40
4	17725	0.39
6	18414	0.40
8	18188	0.39
10	17991	0.40
12	17488	0.41
14	17243	0.40
16	17335	0.40
18	17118	0.42
20	17266	0.39
22	17453	0.39
24	17531	0.39
RSD	2.4%	3.0%

2.3.7 耐用性

照“2.2.2 和2.2.3”项下方法配制供试品溶液和对照溶液，采用自身对照法进行计算结果。通过改变波长（274±2 nm）、流速（0.5±0.1 mL/min）、柱温（30±2 ℃），各条件下测得Dimer 聚合物含量的RSD（n=7）小于6%，说明本方法耐用性良好。验证结果见表5。

表 5 耐用性检测结果

条件	标准条件	流速 0.4 mL/min	流速 0.6 mL/min	波长 272 nm	波长 276 nm	柱温 28 ℃	柱温 32 ℃	RSD
Dimer 聚合物	0.40%	0.41%	0.40%	0.41%	0.39%	0.40%	0.39%	2%

3.讨论

综合分析及评价：对十二肽聚合物检测方法进行了仪器精密度、专属性、检测限与定量限、线性与范围、重复性、溶液稳定性、耐用性的验证，各项验证结果均符合设定要求，该方法适用于十二肽聚合物的检测。

综上，采用BioCore SEC-150（5μm 7.8×300mm）色谱柱能够有效的分离本品中的聚合物杂质，该色谱柱耐用性良好，分离效果较优，能够准确检测聚合物杂质含量，较好的控制产品质量。

公司名称：哈尔滨吉象隆生物技术有限公司

色谱柱信息：纳谱分析 B io Core SEC-150 5μm, 7.8×300mm），SN：395042-000169