一复苏：

1. 冻干粉无需恢复至室温即可操作。

2.用75%酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将管顶端于酒精灯外焰上均匀加热。

3.立即滴2～3滴无菌水于加热部位，使管壁破裂。

4.用镊子或其它适宜工具敲下破裂处。

5.用无菌吸管吸取0.5mL左右液体培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解。

6.将溶解后的菌悬液转移至盛有4～5mL液体培养基的试管中混匀，可将残留在吸管中的1-2滴菌悬液转接至固体培养基上。

7.将液体试管和斜面试管于推荐条件下静置培养，以液体培养结果为准。

二复苏注意事项：

1.打管操作应在生物安全柜中操作。打管时冻干管应远离面部，并适当保护眼睛。

2.打管操作应在烧杯或托盘上方进行，用完的冻干管应高压灭菌处理后丢弃。

3.冻干管打开后需一次用完，不能留存。

4.菌种经过冻干保藏后，处于休眠状态，一代菌种需适当延长培养时间，转接至2-3代恢复活力。一般来说，菌种培养稳定后才能用于后续实验。

三传代

1. 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水，不宜再使用。

2. 冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再传入阳性接种室。

3. 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种环后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种环金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小拇指及掌部夹住硅胶塞，拨开硅胶塞，将接种环伸入管内，先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁，堵上硅胶塞。

4. 左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开硅胶塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使菌种划在斜面表面上。

5. 取出接种棒，在火焰旁将硅胶塞堵上，然后将接种过菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。

6. 培养：将已接种完毕的菌种试管置于培养箱中进行培养。

四注意事项

1.菌种检定菌管理员双人负责发放，并填写记录。

2.菌种应贴有标签，菌种标签应标明菌种的名称、菌种编号、传代日期、传代人、有效期至、贮藏条件；工作菌液标签应标明菌种名称、菌种编号、制备日期、制备人。

3 .遇其中一名管理员休息等特殊情况需要领用的，高级别人员与另一名管理员按照进行发放。

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