主题：【分享】亲和层析纯化蛋白注意事项有哪些？

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发表于：2023/09/06 15:56:14 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

亲和层析依赖于蛋白对基质结合配体的特异性和可逆性结合。该配体可以直接与目的蛋白结合或共价连接到蛋白的标签上。亲和层析通常是最有效的纯化方法，通常用在纯化方案的早期阶段。这种特定的亲和相互作用能够捕获目标蛋白，同时去除溶液中的污染物或其他分子，并一步富集或纯化目标分子，使其与其他不能结合配体的分子分离。

除了理论上蛋白能够通过免疫亲和层析纯化之外，亲和法仅限于具有特异结合特性的蛋白，而免疫亲和层析是所有亲和技术中特异性最强的。下面是关于亲和层析纯化蛋白的注意事项！

一、Ni柱进行蛋白纯化时注意点：

(1)避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，等等；
(2)各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；
(3)各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；

(4) 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；

(5)在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；

(6)缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）

(7)应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；

(8)缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；

(9)可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）

(10)可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；

二、 gst柱进行蛋白纯化时注意点

(1)在细胞裂解时，加入终浓度1–10 mM DTT可以显著提高GST融合蛋白的结合效率，在Binding Buffer和Elution Buffer中加入1–10 mM DTT，可以提高蛋白纯度，但是会导致其产率降低

(2)超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性，导致蛋白不能与介质结合。

(3)在pH值低于6.5或高于8.0结合效率会降低，使用前需用pH6.5～8.0的Buffer如PBS进行平衡；

(4)增大Elution Buffer的pH值。Elution Buffer的pH值调至pH 8–9可以提高洗脱效率而不需要增加glutathione的浓度；

(5)增加Elution Buffer的离子强度。加入0.1–0.2 M NaCl能提高洗脱效率；

(6)Elution Buffer中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍GST融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside可以显著增加洗脱效率

三、 proteinA柱进行蛋白纯化时注意点

(1)介质的选择A,G or 其他，其结合能力的选择

(2)上样流速尽量小，让Protein G和抗体有充分的结合时间

(3)在低pH值洗脱后，快速中和。

(4)长时间保存加入0.02-0.05％叠氮钠；

(5)加入10%甘油，可有效防止疏水作用引起的聚集。

(6)抗体纯度不够，杂蛋白含量高，易引起蛋白的沉淀。

四、亲和层析配体和洗脱条件