白酒色谱分析是应用较广的一个领域，涉及内容较多又有一定的复杂性，广大检测人员在工作中常遇到各种问题和疑惑。今年准备把相关的内容和一些经验汇集整理一下。这是第一篇。
.
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
.
为什么不要用聚乙二醇柱（wax柱、PEG柱、FFAP柱）测白酒中甲醇
.
酒类是重要的食品门类，检测酒类中甲醇是重要的食品安全检测项目。现行国标GB 5009.266-2016规定用聚乙二醇固定相的毛细管柱（俗称wax柱或者PEG柱，也有称为FFAP的改性聚乙二醇固定相）进行白酒或者其他酒类的检测。对于白酒中其他风味成分，GB/T 10345-2022也规定使用聚乙二醇固定相的毛细管柱。聚乙二醇固定相是一种强极性固定相，而目标物甲醇和基体乙醇都是强极性物质，符合所谓的“相似相容原则”，从而使大多数人认为这样选择色谱柱是理所当然的。

然而，这种认识存在很大的误区，对实际的测试应用存在很大的误导，会造成结果不准甚至实验失败。为了纠正这种错误认识，现对以下四方面的问题进行辨析。
.
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
.
1、五花八门，不好选

市面上的色谱柱品牌很多，型号五花八门。按国标要求，应该选择聚乙二醇固定相的毛细管柱用于酒类中甲醇的测定，这类毛细管柱的型号中一般带有wax或PEG之类的关键词，还有一类改性聚乙二醇固定相带有FFAP关键词，也属于同一类型。但是在这个限定下，仍然有非常多的种类，到底应该怎么选呢？是不是随便买一根就能用呢？实际上远没有想象的那么简单。

使用聚乙二醇固定相的毛细管柱测定酒类中甲醇，遇到的最主要干扰物是乙酸乙酯，以及乙缩醛（与乙酸乙酯峰重合），这两个物质在酒类中广泛存在并且含量比甲醇高很多，如果分离不完全，必然使甲醇测定结果不准。对于白酒香气成分分析，需要准确定量乙酸乙酯，也有同样的分离要求。我们来看看是不是所有聚乙二醇固定相的毛细管柱都能胜任这一分离任务。

首先选择了一根安捷伦产DB-FFAP柱，效果如下图a所示，分离很完全，分离度达到2.0以上，可以完全消除乙酸乙酯对甲醇的干扰。安捷伦的色谱柱目前是行业标杆，性能好但非常贵，为了节约成本，能否用国产柱替代呢？我们选择了一根大连中汇达产交联PEG-20M柱，效果如下图b所示，可见分离不太理想，分离度约为1.1，乙酸乙酯大峰对甲醇的干扰不可忽略。这时有人就会说了，国产柱子质量不行，不要贪便宜用国产的。那么用进口柱就一定有好结果吗？我们又选择了一根同样是安捷伦产的HP-innowax柱，效果如图c所示，分离也不尽如人意，分离度只有1.2多，只比国产柱稍微好一点，乙酸乙酯大峰的干扰依然不容忽视。由此可见，分离效果的差异并不能简单的归咎为国产柱质量不行。
.

.
那么，为什么同是聚乙二醇类固定相，分离效果差异会如此明显呢？要搞清楚这个问题，必须弄明白两件事：一是因为不同厂家不同型号的聚乙二醇柱都是有一定差异的，虽然都属于强极性柱，但是其极性强弱存在微小的不同；二是由于甲醇的性质特殊，其保留行为对固定相极性的微小差异十分敏感，形象的形容，就是甲醇比较挑剔。

第一条比较好理解，不同厂家有不同的生产工艺，同一厂家还有不同的产品线，存在差异是正常的。这就好比，同是西瓜，有个大个小不同；同是葡萄有红皮绿皮之分；同是橘子，有的酸有的甜。以安捷伦的产品线为例，其聚乙二醇类固定相有DB-FFAP、DB-wax、CP-wax58、CP-wax57、CP-wax52、HP-innowax等多种，其中DB-FFAP、DB-wax、CP-wax58、CP-wax57属于极性较强的，而CP-wax52、HP-innowax属于极性较弱的。但是总的来说这种差异是不太大的，做大部分其他项目都不会表现出不同的结果。

那么第二条是怎么回事呢？为什么甲醇的保留行为对固定相的微小差异如此敏感？为什么大部分其他物质不存在挑剔的问题呢？这得从甲醇的保留机理说起。甲醇分子量很小，色散力作用很弱；但其分子中存在强极性的羟基，羟基与聚乙二醇固定相形成强烈的氢键作用，正是氢键作用占据了是其色谱保留行为的主导。遇到极性稍强的聚乙二醇固定相，甲醇形成氢键更强烈，保留时间略微延长，与乙酸乙酯的分离度就显著增大了；遇到极性略弱的聚乙二醇固定相，甲醇形成氢键也稍微减弱，保留时间略微缩短，与乙酸乙酯的分离度就明显降低了。其他很多物质也有能有聚乙二醇固定相形成氢键的，但是由于分子量较大，色散力也起到了明显的保留作用，氢键强弱的差异不会表现得像甲醇这么明显。打个比方，就好比普通人掉一跟头发看不出来差别，三毛要是掉一根头发就变成二毛了。

以上分析表明，测酒类中的甲醇需要挑选极性较强的聚乙二醇固定相。那么到底哪些品牌和型号的是极性较强的呢？这个问题似乎没有答案，因为这方面的数据只有厂家知道，用户很难搞清楚，只有买来试过才知道。下图是对市面上多种不同型号的色谱柱进行的对比，有些选择性高、分离度也高，有些选择性较低、分离度不理想。从图中能看出来的规律就是——没有规律：既不能说进口的就一定好用，也不能说哪个品牌的就一定好用。到底买哪种好，只能听销售人员的介绍，遇到销售不专业或者不说实话，那就只能撞大运了。当然，如果有查阅资料和数据库的能力，借助期刊文献和厂家的应用文档也是能够解决的，但是这对采购人员有点强人所难。
.

.
对于某一个测试项目对色谱柱很挑剔的现象，这在药典里面是有专门的术语的，称作“方法的耐用性不好”。市面上的产品必然具有多样性，标准只规定一个基本要求，各家生产都会有自己的特色和差异，色谱柱也是如此，不可能要求不同厂家都生产完全一样的产品。对于一个耐用性好的方法，就是要求市面上大部分（或者平均水平以上）的同类产品都能满足分析性能的要求；不应该存在用A厂产品效果很好，而用B厂、C厂、……产品都测不出来的情况。如果经实验证明该方法确实对色谱柱十分挑剔，市面上只有少数产品能满足要求，那就说明该方法的耐用性不好。耐用性不好的方法在小范围内用于研究测试没问题，但作为标准方法推广实施却是极为不妥的。因为标准是为大范围生产活动服务的，不是为了炫技，更不是为少数厂家打广告。即使这种挑剔性不是刻意为之，也是不应该的，因为这在客观上增加了标准实施的难度，使得采购仪器的人无所适从，使得做测试的人摸不着头脑。
.
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
.
2、温度太低，降温慢

除了上面讨论的固定相对分离效果影响很大外，柱温也会显著影响分离效果。以HP-innowax柱为例，分别在柱温60℃、50℃、45℃、40℃进行实验，分离效果的变化如下图所示，分离度随柱温的降低而显著增加。当柱温为60℃时，乙酸乙酯与甲醇几乎无法分离，只有在柱温不高于50℃时，才能使二者勉强实现分离。对于DB-wax，虽然分离效果优于HP-innowax，但是也存在分离度随温度增加而显著变差的现象，其他各种聚乙二醇固定相也都有类似情况。
.

.
上述现象也是由于氢键的性质决定的。前面已经讨论过，氢键作用对甲醇的保留行为起主导作用。而根据热力学性质，温度升高不利于氢键的生成，甲醇与固定相的相互作用力就会显著减弱，保留时间明显缩短，从而变得与乙酸乙酯难以分离。以上规律本来是对分离条件的选择有指导作用的，使用聚乙二醇固定相分离乙酸乙酯与甲醇应该尽量选择较低的柱温。但是在实际应用中却会遇到困难：仪器想控制较低温度不容易，特别是在夏天室温较高时问题较为显著。一方面柱温接近室温时控温精度会变差，容易出现波动；另一方面，进行完程序升温后，重新降温到接近室温的温度并且达到平衡需要花费很长的时间。下图为岛津GC-2018色谱仪运行完180度的升温程序后降温的曲线，室温约为30℃。从图中可以看出，降温速度是先快后慢的曲线，越接近室温的时候降温越慢。降温到50℃只需要6~7min，若需要降温到40℃并且达到稳定，花费的时间则要增加一倍多。
.

.
虽然不同的色谱仪降温速度有差异，但是基本上都符合上述规律，越接近室温的时候，降温越困难。因此在实际应用中应从节约时间方面考虑，避免使用过于低的初始柱温。GB 5009.266-2016规定使用初始40℃的柱温显然是不太好的选择。而GB/T 10345-2022中给出的初始柱温为35℃，这就更加不合理了，遇到夏天炎热天气，气温甚至都达到35℃，如何实现降温和控温？
.
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
.
3、飘忽不定，不重现

前面已经论证了，乙酸乙酯与甲醇的分离必须低柱温才行，但使用低柱温却很浪费时间。同时，低柱温还会造成一个问题：保留时间飘忽不定。色谱固定相的适用温度范围是有一个下限温度的，在接近或低于下限温度使用时，往往会出现各种意想不到的问题。对于聚乙二醇类固定相，这一现象尤其突出。下图为某PEG-20M固定相的国产毛细管柱在45℃柱温下长时间使用的情况。可以看出，随着低温使用时间的延长，各色谱峰的保留时间逐渐缩短，峰宽也有逐渐增大的趋势，分离度显著降低。
.

.
另一根进口毛细管柱也表现出了类似的现象，只是变化幅度稍微小一些，如下图所示。可见这一反常现象也不应该归咎于国产住质量不好。
.

.
之所以出现这一奇怪现象，也是与聚乙二醇固定相的特殊性质有关的。聚乙二醇是一种结晶性高聚物，当温度低于其相转变点时，将由熔融态转变为结晶态，从而失去色谱保留能力。并且这一转变过程不像小分子物质的熔化/凝固过程那样可以迅速完成，而是缓慢发生转化的。有时候还会出现过冷现象，就是当温度低于相转变点时却不发生转变，体系较长时间处于亚稳态，而在遇到某些特殊刺激时，相转变又迅速发生。总之，聚乙二醇在较低温度下发生相转变是一个很复杂的过程，而不同厂家生产的聚乙二醇固定相一般又具有不同的相转变温度，使得这一问题变得更加复杂。

上面的两个示例中，PEG-20M固定相和Nukol固定相的相转变温度都是55℃左右，因此其最低使用温度应为60℃，低于这一温度使用时就出现了上述反常现象。而另一些型号的聚乙二醇固定相在结构上稍有不同或者经过改性，例如HP-innowax和DB-FFAP柱的最低使用温度为40℃，在柱温为45℃下使用不会出现上述反常现象。若使用温度更低，则仍然会出现意想不到的问题。例如论坛以前的帖子就提到过类似现象：https://bbs.instrument.com.cn/topic/7611024。

上述讨论再次说明，测定酒类中甲醇需要十分谨慎的选择色谱柱，不是任何聚乙二醇类的色谱柱都能适用于较低的柱温，这也再次提高了采购的难度和成本。
.
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
.
4、遇水流失，容易坏

聚乙二醇类固定相怕水的问题已经是老生常谈了，而酒类中必然含有大量水分，这无疑是对色谱柱寿命有一定影响的。这一问题就不再啰嗦了。虽然现在的聚乙二醇固定相都有了很大的改进，稳定性比早期的产品显著提高，怕水的问题不是那么严重了，但是想要忽略不计还是不可能的。直接结果就是换新柱子更勤快了，卖柱子的厂家美滋滋。

除了物理意义上的损坏，聚乙二醇柱怕水还有另外一层意思：水在聚乙二醇柱上将产生强烈的溶剂效应，不仅影响定量准确度，还将导致某些组分的保留时间出现偏差，以至于定性出错。这一问题较为复杂，将在以后另外撰文讨论。
.
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
.
以上列举了使用聚乙二醇柱（wax柱）测定酒类中甲醇存在的四大问题。由此可知，现行国标所列方面并非最优解，值得进一步优化和改进；而相似相容的口诀也是极为片面和粗浅的，我们在选择色谱柱时绝不能简单的只看相似相容一方面。

实际上，关于酒类分析，我国的色谱界前辈已经做了相当系统的研究，也形成了非常成熟的方法。兰化所提出的LZP-930柱经过多年的发展和完善，用于白酒检查可以达到甚至超过进口聚乙二醇柱的效果，并且完全不存在上述提到的四方面问题。实际上GB/T 10345标准的2007版早就是采用LZP-930柱进行白酒分析。而该标准的2022版为何舍弃简单成熟的方法，而采用有问题的方法，其中原因不得而知。这一修改后，酒厂和检测单位需要花更高的价钱、购买更多进口聚乙二醇柱，而结果却是测试变麻烦、问题变多。谁受损、谁得益，自不用多说。

该帖子作者被版主 zyl3367898加 20积分， 2经验，加分理由：原创有奖