藤三七总多糖的制备、鉴别与纯度检查及提取条件优化

1.样品预处理

干燥样品经粉碎机粉碎，过40目筛，置密封袋中，干燥、避光条件下密封保存

2.可见分光光度法测定条件

精密吸取葡萄糖对照品溶液和供试品溶液适量，置10 mL具塞磨口试管中，加入5 %苯酚溶液1 mL，充分混匀后，加入浓硫酸6 mL，40 ℃反应20 min，放置室温，在490 nm处测得吸光度。

藤三七总多糖的制备、鉴别与纯度检查与提取

3.藤三七纯化多糖的制备

取藤三七药材干粉约10 g，精密称定，加入石油醚(60～90 ℃)100 mL回流提取两次，每次2 h，弃去提取液（除去脂溶性成分），药渣烘干，用80 %乙醇100 mL浸泡过夜，回流提取2次，每次2 h。弃去提取液(除去单糖、低聚糖和苷类等小分子物质)，药渣烘干，加蒸馏水100 mL回流，提取三次，每次2 h。合并提取液，减压浓缩至40 mL，即得粗多糖的水溶液。

在粗多糖水溶液中加入Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4：l）10 mL，剧烈震荡20 min，使其充分混合，在4000 r·min^-1转速下离心5 min，弃去中间变性蛋白层和下层有机层，水相继续重复上述操作8次，直至水相与有机相中间无变性蛋白出现为止，即得脱蛋白多糖水溶液。

向脱蛋白多糖水溶液中加入无水乙醇80 mL，使溶液含醇量达80 %以上，充分搅拌，静置过夜。在4000 r· min^-1转速下离心5 min，弃去上清液，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚各洗涤3次，弃去有机溶剂^[2²^-2⁵^]后挥干沉淀，并用真空干燥机抽真空，60 ℃干燥30 min，得到灰白色颗粒状多糖样品。

4.藤三七总多糖的鉴别与纯度检查

(1)Molish试验

(1)供试品溶液：取藤三七多糖10 mg，加10 mL蒸馏水，加热溶解，量取1 mL至试管中，再加入α-萘酚乙醇溶液；

(2)阳性对照品溶液：取淀粉10 mg，加10 mL蒸馏水，加热溶解，量取1 mL至试管中，再加入α-萘酚乙醇溶液；

(3)阴性对照品溶液：量取1 mL蒸馏水于试管中，加入α-萘酚乙醇溶液。

分别摇匀上述溶液，将试管倾斜，沿试管壁慢慢加入浓硫酸，竖直试管观察。结果，供试品溶液与阳性对照品溶液试管中界面呈紫堇色环，阴性对照品溶液试管界面无变化，表明供试品为糖类。

(2)Feling试验

Feling试剂的配制：甲液：取34.6 g酒石酸钾钠KNaC₄H₄O₆·4H₂O，14.2 g NaOH固体溶于80 mL水中，加水稀释到100 mL；乙液：称取7.28 g CuSO₄·5H₂O溶于40 mL水中，加水稀释到100 mL待用。使用时取等体积两溶液混合即可。

(1)供试品溶液：取上述多糖溶液1 mL于试管中；

(2)阳性对照品溶液：取葡萄糖10 mg，加10 mL蒸馏水，溶解，摇匀，量取1 mL于试管中；

(3)阴性对照品溶液：量取蒸馏水1 mL于试管中。

分别加入Feling试剂2 mL，在沸水中加热10 min。结果，供试品溶液与阴性对照品溶液为蓝色，阳性对照品溶液变为砖红色。单糖多为还原性糖，可与Feling 试剂反应产生砖红色，而多糖为非还原性糖，不与Feling试剂反应，结果表明供试品中不含有单糖。

(3)紫外可见光谱分析

将上述供试品溶液在190 ~ 500 nm区间进行光谱扫描，结果在260 ~ 280 nm处无明显吸收峰，而未经脱蛋白处理的藤三七粗多糖水溶液，在260 ~ 280 nm处有明显吸收峰，表明多糖样品中不含有蛋白质、多肽和核酸类物质。

通过以上三种试验证明所制藤三七多糖为不含单糖、蛋白质、多肽、核酸等物质的纯化多糖。

5. 苯酚-硫酸法测定总多糖含量的条件优化

检测波长的选择

吸取一定浓度的葡萄糖对照品溶液 0. 2 mL，用蒸馏水补充至1 mL，加入5 %苯酚溶液1 mL，充分混匀后，加入浓硫酸6 mL，振摇5 min，至40 ℃水中反应 20 min，放置室温，同法制得空白溶液，紫外可见分光光度计在200~800 nm范围内扫描，结果表明最大吸收波长为490 nm。

提取方法的优化

采用正交设计，选用提取溶剂用量(A)、提取时间(B)及提取温度(C)3个因素，每个因素选3个水平，用L₉(3⁴)正交表进行实验设计的优选，见表1。以藤三七总多糖的含量为检测指标，处理组合见表2 ~3。

表.1 The factor-level table

levels	A Quant. of solvent (mL)	B Time (h)	C Temp (℃)
1	10	2	70
2	20	3	80
3	30	4	90

取烘干并粉碎的藤三七药材9份，每份1 g，精密称定，用80 %乙醇浸泡过夜，再用80 %乙醇回流2 h，残渣挥去溶剂，根据正交实验设计，分别加入不同体积水、按不同提取时间、不同提取温度提取。提取液过滤，待冷却后转移于250 mL容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度。精密吸取l mL于试管中，再分别加入5 %苯酚溶液1 mL，充分混匀后，加入浓硫酸 6 mL，40 ℃反应20 min，放至室温，490 nm处测得吸光度。

表2 Results of L₉(3⁴) orthogonal design

Test NO.	A Volume	B Time	C Temp	Content (%)
1	10	2	70	1.662
2	10	3	80	2.531
3	10	4	90	3.418
4	20	2	80	2.314
5	20	3	90	3.194
6	20	4	70	1.803
7	30	2	90	4.022
8	30	3	70	1.904
9	30	4	80	2.760
K₁	2.537	2.663	1.787
K₂	2.433	2.54	2.533
K₃	2.893	2.66	3.543
R	0.64	0.123	1.756

表3 Results of analysis of varianee

Source of variation	Sum of squares	Degrees of freedom	F	P
A	0.379	2	2.958
B	0.03	2	0.254
C	4.663	2	39.517	<0.05
Errors	0.12	2

F_0.05 (2,2) =19.0

直观分析由表2-2可见各因素对总多糖含量的影响为C>A>B，最佳水平组合为A₃B₁ C₃，即加入30倍体积水于90 ℃水浴中提取2 h。

方差分析由表2-3方差分析结果可见：水浴温度对测定结果有显著性影响。

综合分析综合考虑各因素对3个考察指标的影响，确定藤三七总多糖的最佳提取工艺条件为A₃B₁C₃，即加入30倍量体积水于90 ℃水浴中提取2 h。

多糖提取次数的考察称取藤三七药材粉末约1 g，精密称定，按正交试验优选的最佳工艺条件分别提取3次，实验结果见表4。

表-4 Results with the different times