代谢标记富集法由Bertozzi等人提出，用疏水的过乙酰化的叠氮乙酰葡萄糖胺（Ac4GlcNAz）培养细胞，经过系列酶反应后生成可被O-GlcNAc糖基转移酶识别的叠氮化底物类似物UDP-GlcNAz，使糖蛋白带上代谢标签，最后通过亲和树脂实现对O-GlcNAc糖基化蛋白的分离富集。该方法利用特异性化学实现对O-GlcNAc糖肽富集，但由于细胞更倾向于利用内源性的UDP-GlcNAc而对代谢类似物UDP-GlcNAz的利用率较低，影响了富集效果。此外，代谢过程中引入的其他糖基化修饰标签也会造成假阳性的结果。

化学酶促标记法是近年来被广泛使用的O-GlcNAc糖肽富集策略，该方法得益于Gal-T1-Y289L突变体的发现，Gal-T1-Y289L突变体可以将含酮的UDP半乳糖以及叠氮修饰的UDP半乳糖作为供体底物，转糖之后酮官能团与氨氧基生物素形成肟，或者是叠氮基团与生物素基团通过生物正交化学（通常是点击化学）连接起来，从而对O-GlcNAc进行富集。基于Gal-T1-Y289L的富集方法已经取得了相当大的进展，发展了基于生物素可切割接头和基于可逆反应的释放的方法。常规富集方法通常分为两步，第一步：采用重组半乳糖基转移酶 (GalT) 将含有叠氮基的 N-乙酰半乳糖胺 (GalNAz)从相应的尿苷二磷酸连接糖供体共价转移到 O-GlcNAc；第二步： Cu(I) 介导的叠氮烷基环加成 (CuAAC) 反应将叠氮官能团转移到含有炔基的小分子上。两步化学酶标记方法可以使用不同的糖基转移酶，应用于复杂聚糖的检测，但是由于连接缓慢以及细胞内具有各种副反应，第二步反应通常不完全。浙江大学易文教授研究组推测仅依赖酶转移的一步标记策略，显著提高了糖基化蛋白质的鉴定灵敏度。他们利用计算机辅助设计生成GalT 突变体，能够将生物素修饰的 UDP-GalNAc 类似物转移到 O-GlcNAc，并且通过实验验证了一步法标记显著改善的普遍性。利用一步标记方法成功鉴定到新的O-GlcNAc修饰蛋白FEN1，揭示了FEN1在DNA损伤修复中的动态调节作用。^[12-13]

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3-3.docx(未验证)