一、操作程序

1、开机前的准备

(1) 按照测定项目的要求选择合适的色谱柱（维生素 B1 B2 ：

C 18柱，维生素 K1：C18 -Zn 柱），配制好所需的流动相，所有

流动相都需要进行过滤，根据需要选择不同的滤膜，一般为

有机系和水系，常用的孔径为 0.22um（液质）和 0.45um（液

相）。

(2) 对抽滤后的流动相进行超声脱气 30min。

(3) 将选定的色谱柱与系统连接好，将流动相放到相应仪器的

流动相托盘中。

(4) 检查流路是否正常，重点检查是否漏液。

2、开机

(1) water 液相色谱仪

检查电路是否连接正常，先打开电脑，再分别打开仪器

泵、自动进样器、检测器、柱温箱的电源开关，最后双击桌

面 BREEZE/empower 图标，输入用户名密码，点击确定。

(2) 岛津液相色谱仪

打开顺序同 2(1)，最后双击桌面 Lc solution 图标。输入

用户名 Admin，点击确定。

3、方法编辑

(1) water 液相色谱仪

在工作站的界面中选择“查看方法”，根据分析样品所需

条件依次改变其中泵（流速）、检测器（波长）、柱温箱（柱

温）、自动器的参数，然后保存方法。在工作界面中平衡系

统按钮，加载方法，平衡系统。

流速

波长

柱温

进样量

激发波长 375 nm，

发射波长 435 nm

激发波长 462 nm，

发射波长 522 nm

激发波长 243 nm，

发射波长 430 nm

维生素 B₁

维生素 B₂

维生素 K₁

0.8 mL/min

40℃

10μL

0.8 mL/min

1.0 mL/min

40℃

35℃

10μL

20μL

(2) 岛津液相色谱仪

在工作站的界面中选择编辑方法，根据分析样品所需条

件依次改变其中泵（流速）、检测器（波长）、柱温箱（柱温）、

自动进样器的参数。然后保存方法，点击下载，将方法条件

加载到仪器中，平衡系统。

4、运行

(1) water 液相色谱仪

① 单次运行

单击单次运行，出现对话框，选择已经编辑的方法，输

入文件名，输入样品瓶，样品架和样品的体积，单击确定，

进行样品的分析。单击工作界面的停止按钮就可以停止分

析。

② 批处理运行

在运行样品列表中的样品序列，单击 PATE/WELL 以下

的空白单元格，选择样品瓶位置，依次输入进样体积、进样

数、样品名称、功能（选择进样的功能，如进标准样或进样）、

运行时间，选择进样的方法。单击开始运行样品组按钮，开

始分析样品。

③ 关机

样品分析完毕，运行关机程序，按照色谱柱的冲洗要求

进行冲洗。冲洗完后，关闭电源开关。

(2) 岛津液相色谱仪

① 单次运行

同 4（1）。

② 批处理运行

单击批处理，打开二级菜单，单击向导，可以新建，也

可以附加一个批处理文件。选择方法文件，输入开始样品瓶、

样品架、进样体积。下一步，输入样品组数，选择标准品和

未知。下一步，输入标准品名字，ID，校准级别，数据文件

名。下一步，输入未知品名字，ID，数据文件名。下一步，

下一步，完成。出现批处理文件，另存批处理文件。单击批

处理开始，开始分析样品。

③ 关机

样品分析完毕，下载关机方法（检测器灯设定为关，泵

流速为 0，柱温箱温度关闭），将色谱柱按照色谱柱的冲洗要

求进行冲洗。冲洗完后，关闭仪器电源开关。

5、计算

(1) water 液相色谱仪

① 打开标准进样的数据文件，点击处理方法向导，选择新建

处理方法，确定，对谱图进行积分处理；下一步，选择峰宽

及阈值；下一步，选择最小峰面积及最大峰面积；下一步，

定量方法选择面积，校正曲线拟合型选择线性；下一步，输

入各组份化合物名称；下一步，输入配制标液的浓度及单位；

下一步，选择外标法校正；下一步，输入方法名称，完成。

② 单击查询数据，打开进样分析结果数据列表，选择数据文

件，右键选择处理和报告，选择使用指定的处理方法，加载

做好的标准曲线，进行定量处理。

(2) 岛津液相色谱仪

单击向导，打开化合物表向导窗口，选择通道，半峰宽，

斜率，最小峰面积，一般选择面积选项；下一步：选择要标

定的峰；下一步：选择外标法、计算面积，输入校准级别、

曲线拟合类型、一般选择线性。加权方法：无。输入浓度；

下一步：识别，选择时间窗或者时间带（一般来说保留时间

小的用时间窗）；下一步：定义峰的名字和标样的浓度；完

成，保存方法。

在批处理表中，将处理方法更改为新建立的方法，设定

校准级别，处理数据。点击“校准”，查看标准曲线；返回，

点击数据文件，查看样品数据。

二、适用范围

适用于岛津 LC-20A、WATERS 1525 和 2695E 高效液相色

谱仪的使用操作。

三、注意事项

(1)流动相均需色谱纯试剂，水用 18MΩ 的去离子水。流动相

配制完毕，需过 0.45um 滤膜，抽滤后超声脱气。

(维生素 B1 B2 流动相：0.05mol/L 乙酸钠溶液：甲醇＝65：35

维生素 K₁流动相：900 mL 甲醇+100 mL 二氯甲烷+0.3 mL

醋酸+1.5g 氯化锌+0.5g 无水乙酸钠)

(2)泵流速应合适设定，否则会造成柱压力过大，损坏柱子。

柱压力最好不要超过 4000psi。

(3)开机中如需更换色谱柱或零件，应先停止流速，待压力下

降稳定后再作处理。

(4)仪器发生异常时，应切断电源，待仪器稳定后再作处理。

因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结晶，有损色谱柱，所以每次

由有机相变为缓冲盐流动相或由缓冲盐流动相变有机相均

需用水相充分清洗(走完 VB1 B 2后用 10%甲醇冲洗)。

(5)仪器使用环境：控制在室温为 10-30℃，湿度为 10%-85%。

(1)流动相均需色谱纯试剂，水用 18MΩ 的去离子水。流动相

配制完毕，需过 0.45um 滤膜，抽滤后超声脱气。

(维生素 B1 B 2流动相：0.05mol/L 乙酸钠溶液：甲醇＝65：35