主题：【求助】请教PCR技术

mouse回复于2007/05/08

材料、设备及试剂

　　一、材料

　　不同来源的模板DNA。

　　二、设备

　　移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。

　　三、试剂：

　　1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。

　　2、MgCl2 ：25mmol/L。

　　3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。

　　4、Taq DNA聚合酶5U/μl。

　　5、T4 DNA连接酶及连接缓冲液：配方见第五章。

　　6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。

　　7、其它试剂：矿物油（石蜡油），1% 琼脂糖，5×TBE，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇和70％ 乙醇。 





第三节　操作步骤

　　一、PCR反应

　　1. 依次混匀下列试剂

　　　35μl H2 O

　　　5μl 10×PCR反应缓冲液

　　　4μl 25mmol/L MgCl2

　　　4μl 4种dNTP

　　　0.5μl 上游引物（引物１）

　　　0.5μl 下游引物（引物２）

　　　0.5μl 模板DNA(约1ng)

　　混匀后离心5秒。

　　2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

　　3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

　　二、电泳

　　按第二章所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。

　　三、PCR产物的纯化

　　扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。

　　（一）酚/氯仿法

　　1.取反应产物加100μl TE.。

　　2.加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中. 这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。

　　3.再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。

　　4.在水相中加300μl 95％乙醇,置-20℃下30min沉淀。

　　5.在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入1ml 70％乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。

　　（二）Wizard PCR DNA纯化系统

　　Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。

　　该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：

　　　50ml Wizard PCR DNA纯化树脂

　　　5ml 直接提取缓冲液

　　　50支 Wizard微型柱

　　1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。

　　2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。

　　3、加1ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。

　　4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。

　　5、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml 80%异丙 醇，对微型柱进行清洗。

　　6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。

　　7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。

　　8、丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。

　　[注意] 1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。

　　　　　　2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。

　　四、载体加dT尾

　　1.将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。

　　2.在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。

　　3.加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2h。

　　4.按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。

　　5.加入2倍体积 95％乙醇,在-20℃下沉淀1hr。

　　6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。

　　五、PCR产物与载体粘末端连接

　　1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。

　　2、加1ml T4DNA连接酶，1ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。

　　3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

　　六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接

　　1. 在50ml的PCR产物中,直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混匀。

　　2. 37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。

　　3. 用酚:氯仿抽提2次。

　　4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。

　　5. 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1ml （约0.1mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1ml ，连接缓冲液1ml 。

　　6. 取5ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

　　[注意]1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。

　　　　　2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。

　　　　　3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

　　　　　4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。

jun来也回复于2007/05/08

楼上的朋友已经解释的较清楚了。补充一些！

PCR：聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史
PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

聚合酶链式反应，一种人工在体外进行DNA基因片断扩增的方法。用于检验，灵敏度极高。比如要检验人体内是否有某个病毒。只要样本中有一个DNA分子片断，就可以通过倍增的方法迅速复制这个分子片断。复制的数量呈指数增长，几十次就可以以得到足够的分子样本进行后续的检验了。

PCR是在体外由酶促合成特异DNA片段的一种新方法。在反应液中含有模板DNA、人工合成的目的片段的5′端和3′端PCR引物、合成DNA的四种脱氧核苷酸底物（dNTP）、一种耐热的DNA聚合酶（Taq酶），以及含各种离子的缓冲液。此反应体系由高温变性、低温复性及适温延伸等步骤共同组成一个周期，然后反复循环进行，使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是，待扩增的模板DNA在94℃高温下解链成为单链DNA；低温复性时人工合成的两个寡聚核苷酸引物分别与目的片段两条链的两端互补结合；在72℃时Taq酶可将dNTP从引物3′端开始掺入，沿模板DNA5′→3′方向延伸，合成一条新的互补链。由于每一周期所产生的新DNA链均能成为下一循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经过25~30个周期后，一般可扩增至106~107。PCR技术由于有操作简便、省时间、特异性及敏感性均较高等特点，所以一经问世，就得到了广泛的应用，许多条件较差的实验室，也得以开展分子生物学研究，故可看作是分子生物学技术的一次革命。在PCR反应的各种成分中，模板DNA和引物是两个重要因素，虽然PCR敏感性很高，可以检测微量DNA的用量，以不低于0.1μg为宜。模板DNA的纯度要求不是很严格，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶及Taq酶抑制剂。引物是决定PCR结果的关键，引物长度以15~30个碱基为宜；（G+C）约占总碱基中的50%；两个引物之间不应发生互补；应尽量减少重复的碱基，特别是在3′端。PCR可用于扩增DNA或RNA。在扩增RNA时必须先用反转录酶合成cDNA第一链，然后进行PCT扩增，这种方法称为逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。目前PCR技术在肿瘤研究中也得到广泛的应用。例如从肿瘤细胞提取基因组DNA然后用设计好的对某个基因特异的OCR引物，如p53基因第5~8外显子的引物，进行PCR扩增，然后用单链DNA构型多态性（SSCP）分析技术或直接DNA测序技术，研究p53基因的点突变。RT-PCR技术广泛应用于检测某个癌基因、抑癌基因或其他肿瘤相关基因的过度表达或低表达。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。