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主题：【原创】求助各位，回收率太低，该如何优化

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发表于：2024/11/01 22:20:50 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
请教各位，我在做磷酸吡哆醛和叶酸的液质回收率实验中，样品血清的蛋白沉淀剂用的是甲醇乙腈（v:v=1:1)，流动相A是0.1％乙酸和1mM乙酸铵，B是纯甲醇，样品氮吹干后复溶，复溶液选择的是不含乙酸的初始流动相甲醇水（v:v=4:96），但回收率一直不太理想，磷酸吡哆醛只有10％多非常低，叶酸在60％以上。请问各位大佬，我可以从哪些方面继续优化呢，我现在在思考是否是血清中的蛋白成分和目标物结合并沉淀出去了，或者是复溶液没有溶解干净，所以想着蛋白沉淀剂中加入乙酸看看能不能让复合物分离，或者是复溶液加0.1%乙酸促进溶解，不知道这个思考方向对不对，感谢各位大佬！
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2024/11/4 13:23:53 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这个步骤比较多，建议在你怀疑的几个关键位置反证明一下，比如怀疑复溶液没有溶解干净，可以前面步骤正常进行，在吹干前定量加入标物，吹，再复溶，正常体积溶剂复溶检测，浓缩用的容器再用溶剂继续复溶，保留液体，如正常复溶回收率低，进一步检测二次复溶溶液，查看结果。如二次复溶未检出或很少，不足以匹配定量加入的标物量，那就要考虑是不是吹的过程影响其含量，比如有些农残就不能吹至干，要近干，依次查找
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hujiangtao
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2024/11/4 15:15:45 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
吡哆醛和叶酸属于水溶性维生素，沉淀在蛋白中可能性不大，我觉得可能是氮吹时吹干影响比较大，近干就可以。

楼主可以定量吸取血清加入稍微高一点浓度的吡哆醛和叶酸然后按加乙腈沉淀蛋白，离心后不用氮吹直接过膜上机看一下目标物是否被沉淀了。液质容易受基质效应影响，一定要用基质标定量
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2024/11/4 15:16:30 Last edit by hujiangtao
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2024/11/4 19:01:29 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
回收率太低其实可以考虑内标发来校正，或者采用基质曲线
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2024/11/4 21:40:28 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 joufe(joufe) 发表:这个步骤比较多，建议在你怀疑的几个关键位置反证明一下，比如怀疑复溶液没有溶解干净，可以前面步骤正常进行，在吹干前定量加入标物，吹，再复溶，正常体积溶剂复溶检测，浓缩用的容器再用溶剂继续复溶，保留液体，如正常复溶回收率低，进一步检测二次复溶溶液，查看结果。如二次复溶未检出或很少，不足以匹配定量加入的标物量，那就要考虑是不是吹的过程影响其含量，比如有些农残就不能吹至干，要近干，依次查找
谢谢老师！但是我的复溶液体积很小（只有50μL），如果只是吹近干的话会不会对浓度测定有比较大的影响，不知道这方面老师有什么建议和看法吗
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2024/11/4 21:40:59 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 hujiangtao(hujiangtao) 发表:吡哆醛和叶酸属于水溶性维生素，沉淀在蛋白中可能性不大，我觉得可能是氮吹时吹干影响比较大，近干就可以。楼主可以定量吸取血清加入稍微高一点浓度的吡哆醛和叶酸然后按加乙腈沉淀蛋白，离心后不用氮吹直接过膜上机看一下目标物是否被沉淀了。液质容易受基质效应影响，一定要用基质标定量
谢谢老师！我就是用的基质标进行定量的
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