52 大肠菌群
52.1 多管发酵法
52.1.1 测定范围
本法适用于大肠菌群的测定。
52.1.2 方法提要
根据大肠菌群细菌具有的生物特性,如革兰氏阴性无芽胞杆菌,在37℃培养24h能发酵乳糖并产气的特点,将不同量的水样接种到含乳糖的培养基中,经培养后根据阳性反应结果可测出原水样中大肠菌群的MPN值。
52.1.3 培养基和试剂
52.1.3.1 乳糖胆盐发酵培养液
52.1.3.1.1 成分:
单料 双料
蛋白胨 20g 40g
猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g 10g
乳 糖 10g 20g
0.4%溴甲酚紫溶液 2.5mL 5mL
蒸馏水 1000mL 1000mL
52.1.3.1.2 制法:将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中,调pH到7.4,加溴甲酚紫溶液,混匀,分装试管(每支试管中倒置一只小倒管),每管10mL。以115℃(10zb)20min灭菌。
52.1.3.2 亮绿乳糖培养液(BGB)
52.1.3.2.1 成分:
蛋白胨 10g
乳 糖 10g
牛胆盐 2g
亮 绿 0.0133g
蒸馏水 1000mL
52.1.3.2.2 制法:除亮绿外,将其他成分溶于蒸馏水中,调pH到7.2,加入亮绿,混匀,分装到带有倒管的试管中,每管10mL,115℃20min灭菌。
52.1.4 仪器
52.1.4.1 试管:150mm×20mm,140mm×15mm。
52.1.4.2 小倒管。
52.1.4.3 定量分装器。
52.1.4.4 其他仪器同51.4。
52.1.5 检验步骤 检验程序见图8。
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│水 样│
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乳糖胆盐发酵 │36±1℃
培养液 │24h
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│不产气│ │ 产气 │
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│大肠菌群阴性(-) │ │大肠菌群推测性试验阳性(+) │
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推测性试验 │
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亮绿乳糖胆盐36±1℃48h
│
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│不产气│ │产 气│
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│大肠菌群阴性(-) │ │ 大肠菌群阳性(+) │
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图8 多管发酵法检验程序
52.1.5.1 矿泉水水源水 推测性检验
52.1.5.1.1 取10mL水样接种到盛有10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中,共接种5份。
取1mL水样接种到盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中,共接种5份。
另取1mL水样接种到9mL灭菌生理盐水中,混匀,用5mL灭菌吸管吸取5mL,分别加到5支盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中,每管1mL(即0.1mL水样)。
52.1.5.1.2 轻摇试管,使液体充分混合,置36±1℃培养箱内培养24h。
52.1.5.1.3 观察每管是否产气,若有气体产生该管则为推测性检验阳性。
52.1.5.1.4 如不产气则为大肠菌群阴性。 证实性检验
52.1.5.1.5 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液,接种到亮绿乳糖胆盐培养液(BGB)管中,置36±1℃培养箱中培养48h。
52.1.5.1.6 观察BGB管中的产气情况,如有气体产生,就可确定为“大肠菌群阳性”;如无气体产生则为“大肠菌群阴性”。
52.1.5.1.7 记下BGB管里产气的阳性试管数,查表19可得出水样中大肠菌群的MPN值。
52.1.5.1.8 MPN值的计算
如水样含菌量少,也可按100,10,1mL接种,那么其实际MPN值应为表中的MPN值除以10;反之如含菌量较多,也可接种1,0.1,0.01mL,其实际MPN值应为表中的MPN值乘以10,余类推。以下列举说明。
假设推测性检验15支试管中的阳性管数如下:
在接种量为10mL的管中有5支管阳性;
在接种量为1mL的管中有4支管阳性;
在接种量为0.1mL的管中有2支管阳性;
作为推测性检验结果为5-4-2。当把以上阳性管转种到BGB管里,经培养后,作为证实性检验所给的结果如为5-3-1,那么查表19,就可知大肠菌群的MPN值为每100mL水样中110。接种量为100,10,1mL时,MPN值为11。如接种量为1,0.1,0.01mL时,MPN值即为1100。