四、实例 下面以全反式维甲酸为实例来简单的说明色谱-质谱方法建立的过程,以及样品预处理过程中注意的事项。
首先,全反式维甲酸的结构式如图5所示,其主要理化性质为:
易溶于DMSO,溶于乙醇,微溶于水;对热不稳定,见光易分解。从上述信息我们可以大概的了解——配制溶液时,溶媒我们应选择无水乙醇,其价格便宜,毒性小,而且溶解性也能满足要求;从结构式来看,由于含有羧基,我们在检测时应使用负离子模式,而且在进行MRM监测时,碰撞能量不能太大,这是因为能量大将不能形成稳定的碎片离子;再者,由于在支链上含有共轭双键,这决定了维甲酸的不稳定性,因此,我们在进行样品处理时就必须注意操作环境。
图5![]()
掌握以上信息后,我们使用waters公司的UPLC-Quattro Micro Mass联用仪对该化合物的质谱条件进行了优化,采用注射泵直接进样,优化后的参数如下:Capillary(毛细管电压):-3.0 kv;Cone(锥孔电压):-40 v; Collision(碰撞能):18 ev;其定量离子反应为:m/z 299.5 →m/z 255.2。
确定质谱条件后,我们对色谱条件进行了优化。在这里最主要的是根据化合物的极性大小选择合适的色谱柱,由于该化合物含有羧基,极性相对较大,我们就选用C8填料的色谱柱为分离媒介。同时为了有助于化合物的离子化,加入一定浓度的乙酸,对峰型的改变也有一定程度的作用。
色谱质谱条件确定后,就需要考察一下样品的提取条件。当时我们考察了沉淀蛋白和液液提取两种方法,前者基质效应明显,背景噪音很大,不能满足我们测定的灵敏度;后者得到干净的复溶液,并能满足我们的测定要求。但在使用液液提取时,有一个问题出现——全反式维甲酸转化成顺式维甲酸、多种氧化产物,这对我们的测定非常不利。考虑到全反式维甲酸对光、热的不稳定性,我们在进行样品预处理时,选择了避光、冰浴上操作,这样就可以有效的降低全反式维甲酸的转化。样品经上述方法处理后,进样分析,得到的色谱图如图6所示。
图6
五、仪器使用维护经验1.严格按照仪器的SOP进行操作,否则容易引起仪器故障;
2.对
液相使用熟练的操作人员,在使用液质时尤其要注意三个方面的问题:一是液质的流速不能太大,若流速太大对于ESI源而言不易于离子化,而APCI源流速可以在0.5——1.0mL/min;二是流动相的添加剂,不管是缓冲盐还是酸、碱,必须是易挥发的,否则容易堵塞管路和源内的毛细管;三是在
液相操作中,我们经常使用三乙胺作为扫尾剂,但是在液质中尽量不使用三乙胺,使用前请咨询工程师,看看三乙胺的浓度不高于多少对仪器影响甚微;
3.定期清洗离子源,尤其在使用沉淀蛋白法处理生物样品时,离子源很容易脏,定期清理可以提高灵敏度。再者每天做完样品分析后,要及时清洗
液相系统,及时冲洗和吹扫管路;
4.机械泵的震气,这个可能只有waters的仪器需要。震气是为了将机械泵及其管路内的灰尘颗粒清除出去,以提高灵敏度;
5. 去污剂、表面活性剂会产生离子抑制现象, 表面活性剂产生的加合物和离子簇会干扰质谱数据,因此不要使用洗涤剂清洗玻璃器皿等容器,如果一定要用,建议超声清洗多次。