3.优化色谱条件
确定好了色谱柱、流动相、内标和前处理方法,下面就是要正式开始优化条件了,有干扰的避干扰,能缩短分析时间就缩短分析时间。
1)首先调节流动相比例、柱温,使得样品峰和内标能够分开,且总的分析时间在10min以内。
2)做空白血浆加标的样品,看有无干扰。果然,不出所料,样品峰和内标处均有干扰,继续优化流动相比例、柱温、流速等参数,样品峰处基本无干扰了,但是干扰峰始终在内标峰出徘徊。
3)下面开始了排除血浆干扰的优化工作。
A.走梯度:甲醇走梯度,基线波动太大,有机相换成乙腈,样品峰响应下降,峰变宽,也不合适,失败。
甲醇走梯度
有机相改成乙腈
B.前处理改用提取:虽然不愿意,但是用乙醚还是试了一下,结果,提取还是有干扰,也不行。
C.改变流动相水相的pH值:调了几个pH值 3.0, 3.6, 4.3,结果发现,干扰峰对于流动相的pH值比较敏感,随着pH值的升高,干扰峰的保留时间会降低,当然样品峰和内标峰也会有同样的趋势,只是没有干扰峰那么敏感。最后把pH值调成3.4时,干扰峰终于可以在样品峰和内标峰中间出峰。而且做了6份不同来源的血浆,干扰峰均在样品峰和内标峰中间出峰。
pH 4.3
pH3.6
pH3.0
pH3.4
4)但是新的问题出来了,样品峰和内标峰的保留时间出现了漂移,老是不稳定,怀疑可能缓冲液的缓冲能力不够,于是缓冲盐的浓度加大了一倍,果然,保留时间稳住了,呵呵!
5)下面开始配血浆标准曲线,看线性。线性还是很好的,每次都能达到3个9以上,但是柱压阿,一直让我很担心。进一针,往上跑一点,虽然每次冲柱后能降一些,但是还是有上升的趋势。这对于我大批量样品而言,是很不合适的。看来用甲醇硫酸锌沉淀不太合适。尽管以前这种沉淀剂我也用过,但是那时候是Agilent的柱子,且粒径是5μm的。可能对于Waters的这一型号的柱子,用盐或者是不太完全的蛋白沉淀方法不太合适。
6)有得重新选择沉淀剂,最常用的还是甲醇和乙腈。乙腈沉淀效果好,所需的用量也相对少。但是样品在乙腈中响应就是低,峰也太宽。不行还是得用甲醇。可是问题来了,甲醇的用量大,样品的稀释倍数就多。不过甲醇沉淀,也基本能满足我500ng/mL的LLOQ的要求。但是峰形就是没有我用硫酸锌沉淀的好。
7)尝试优化峰形。考虑到甲醇硫酸锌沉淀中是有水(用来溶解硫酸锌的),可能是受到溶剂效应的影响,我就尝试着在甲醇沉淀后,上清液又加水的方法,果然,峰形变好看了,峰也瘦了,而且虽然加了水,但是峰高与不加水比基本没有下降。
8)最后我用30μL进样,LLOQ能做到200ng/mL。