主题：【分享】荧光探针标记样品的过程及注意事项

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pfz1985

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发表于：2010/06/17 07:15:40 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

对细胞进行荧光标记后，有时会出现影响定量实验的三种情况。

一是所有细胞都能标记上荧光，但样品荧光强度过高，甚至饱和。克服方法是降低标记细胞时胞外荧光探针的浓度；或改变标记样品的条件，例如减少标记探针与样品的反应时间。

二是出现“环岛效应”或“边缘效应”，表现为即连成片的细胞最外环的边缘的细胞荧光强度明显高于被包围在中间的细胞的荧光强度。克服办法是①在不影响实验的情况下，尽量减低细胞种植密度；②由于染料浓度过高时，更容易产生边缘效应；③适当延长标记时间，以使染料在细胞间达到充分的平衡时间；④染色后，上机前要进行充分洗涤附着探针(不需要洗涤的探针除外

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2010/6/17 7:15:58 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

三是所有细胞荧光都很弱。荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：①所使用的荧光探针浓度过低。②标记条件不适当：孵育的时间、温度不当，大多数情况下都是样品与探针孵育温度太低或时间太短造成。③荧光探针失效。这是一种很常见的标记失败原因。荧光探针一定要低温保存、不要反复冻融、应用液现用现配制，另外其要在保质期内使用。④所用介质、pH值不适当。⑤细胞状态不正常。有一些探针只标记活细胞如果细胞活性不够则难以标记上荧光。⑥探针溶解不充分。⑦探针泄露。如FDA标记细胞后，应在40分钟内测定，否则其从进入开始，120分钟后，其荧光就只剩下约10%，细胞内的荧光探针大部分泄露到细胞外。⑧探针选择错误。⑨荧光干扰。样品中的自发荧光光谱范围很宽，有时会干扰正常细胞染色。⑩荧光重合。除非具备能分开两种光谱相近的仪器设备，应尽量避免两种光谱相近的荧光探针出现在同一样品中，以免引起荧光光谱的重合。⑾观察的荧光条件不适宜。⑿有淬灭剂存在，如果介质中含有淬灭剂，也会使荧光下降或完全淬灭。⒀其他原因：例如，加入试剂种类、顺序错误、漏加试剂及不当的操作均可导致荧光标记失败。在整个实验操作中，还要避免对样品结构造成意外损伤和有关污染影响实验结果。所有荧光标记操作要避光进行，防止光敏效应引起的荧光淬灭或增强等变化。减少的办法是：①控制细胞内探针浓度不要过高；②尽量减少预览及检测时光源照射强度、缩短光照时间、增大检测器的灵敏度；③对于固定样品可用防淬灭剂；④在淬灭严重影响测定的情况下，应考虑换用不易淬灭的探针、改变标记条件或方式。

要防止非特异性标记，正确的设立对照组，防止假阳性和假阴性的出现。荧光标记后，要尽快上机采集图像，防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。

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