二、薄层色谱检测方法 薄层色谱的定量检测有吸收测定法、荧光测定法和荧光猝灭法。对在可见及紫外光区有吸收的化合物可用钨灯和氘灯在200~800nm范围进行透射和反射吸收法测定。化合物本身或者经过色谱前和色谱后衍生化生成对紫外有吸收并能放出更长波长的化合物适用荧光法测量,荧光法灵敏度高,最低可测至pg级。本身无颜色、又无特征紫外吸收或荧光,并且不易衍生的化合物可采用荧光猝灭法测量,使用含有荧光剂的薄层板。薄层色谱扫描仪的常见扫描方式有直线扫描、锯齿扫描、飞点扫描、圆形扫描、倾斜扫描和多通道自动扫描等,分别采用单波长或双波长的测光形式。除此之外,薄层色谱还可与其他分离分析技术联用,更有利于化合物的定性鉴别和定量检测。
(1)薄层色谱-傅立叶变换红外光谱联用检测
化合物的红外光谱能提供丰富的结构信息,是定性的有力手段,也可以用于定量。目前薄层色谱和红外技术联用主要采用原位法、光声光谱检测法(PAS)、自动洗脱物转移法和红外显微镜法。原位法是采用改装的DRIFTS附件,由步进马达驱动TLC板,对色谱斑点进行红外测量。由于TLC固定相有强红外吸收,分析物吸收带容易发生畸变。光声光谱法是将TLC板上附着有分析物的固定相依次转移到PAS附件中进行FTIR-PAS分析,再用差谱方法扣除固定相的吸收,得到分析物光谱图。同原位一样,固定相的强红外吸收会对分析物光谱产生干扰。自动洗脱转移法使用TLC-FTIR自动接口。样品在常规板上展开后,将板旋转90°,用螺丝固定在带有样品杯的金属部件上,杯中充有KBr或KCl粉末,杯底部的金属丝芯和TLC板接触,将板置于转移附件里,展开的各组分会被转移附件罐里的溶剂推向顶部,借助金属丝芯的毛细作用进入杯中。转移完,用干燥空气流吹洗各样品杯表面,使杯中溶剂挥发,组分沉积在杯顶部的KBr表面上,最后进行红外扫描。红外显微镜法是用氧化钴作固定相涂在显微镜载片上,样品在氧化钴上展开后直接用红外显微镜测量,用氧化钴代替硅胶和氧化铝,可消除固定相的干扰。
(2)薄层色谱-拉曼光谱联用检测
拉曼光谱和红外光谱都属分子振动光谱,前者为散射光谱,后者为吸收光谱,分子偶极矩越大,红外吸收强度越大;振动时分子极化率改变越大,拉曼散射越强,所以通过两种光谱的相互配合、补充,可以更好地解决化合物结构测定问题。
薄层色谱和表面增强拉曼光谱(SERS)联用较多。表面增强拉曼要求检测的分子必须含有芳环、杂环、氮原子、硝基、氨基、羧酸基以及磷、硫原子,因为这些基团可通过孤电子对或π电子与表面增强基底相互作用,从而产生拉曼散射增强效应,样品用量可低至数微克。常用表面增强基底为银溶胶,通过硝酸银、柠檬酸三钠经氧化-还原反应制备,该银胶具有很强的表面增强活性,滴洒在薄层斑点原位,水分挥发干后测FT-SERS谱。
(3)薄层色谱-质谱联用检测
相比其他联用技术,质谱是一种灵敏度高、选择性好、可提供丰富的组成和结构信息、能够进行有效定性的现代分析手段。薄层色谱与质谱的联用,实现了优势互补,更利于复杂样品的定性。由于分离后的薄层色谱体系包括过量吸附剂、粘和剂、荧光指示剂,残余溶剂和盐等,每一个斑点都很难达到完全纯净,因而对质谱的接口提出了更高的要求。目前常见的接口技术有以下几种:①提纯直接引入法。提纯直接引入法是实现T
LC-MS联用的最简单方法,也是广泛采用的方法。在这种方法中,TLC和MS的联用是离线的,薄层色谱仅作为一种分离提纯方式。样品经薄层色谱分离后,斑点从板上转移,用适当的溶剂洗脱,蒸去溶剂后精制得纯品,再将纯品注入质谱计进行分析。②热蒸发法。该方法适用于易挥发、热稳定、分子量小的样品,样品分子受热蒸发,从而直接同吸附剂分离。③特殊洗脱技术。特殊洗脱技术包括许多设计巧妙的仪器装置和方法,使溶剂能有效将样品洗脱并迅速转移至质谱计,连续性好。④毛细管技术。毛细管可以广泛用于T
LC-MS接口上。利用高温高压迫使溶剂从薄层板转移至坯中渗滤,从而使样品快速流过毛细管,直接进入快原子轰击电离(FAB)室或其他电离室,这与加压薄层色谱原理相似,但不需要泵,设备小巧易制,连续性好。
其次,实现TLC与MS联用,还要考虑质谱中样品分子的电离方法。传统的电子轰击源(EI)和化学电离源(CI)均可应用于T
LC-MS。还有一些新的分子离子化方法,如快原子轰击(FAB)、二次离子质谱(SIMS)和基质辅助激光解吸(MALD)等。这些新的离子源的使用,使T
LC-MS在化合物定性方面更加快速、准确、灵活,大大扩展了薄层色谱的应用。
除此之外,还发展有T
LC-MS-MS技术。串联质谱可提供比单一质谱更详细的信息,且不受背景离子的干扰,不受共色谱体系污染。将串联质谱同薄层色谱联用,同T
LC-MS联用一样,可采用"手动方式"或"仪器方式"连接。此技术广泛应用于合成化合物和天然产物。
(4)薄层色谱-核磁共振联用检测
核磁共振与红外光谱、质谱比较,灵敏度相对较低,但核磁共振能提供的原子水平上的结构信息,这是其他方法无法比拟的。薄层色谱-核磁共振的方法是将样品用薄层色谱展开后,刮下样品薄层斑点,再用氘代试剂将样品洗脱下来,进行核磁共振检测。受核磁共振灵敏度所限,这种分析需样量较大。
(5)薄层色谱-电化学方法联用检测
薄层色谱与各种电化学方法联用操作简单,将薄层色谱分离出的样品斑点刮下,直接加入电化学反应溶液中即可获得电化学检测与分析结果。
(6)其他联用检测
薄层色谱可以与高效
液相色谱(HPLC)联用,一些样品组成复杂或含量极微时,直接采用高效
液相色谱分析比较困难,可用薄层色谱先分离、纯化,将样品在薄层的斑点洗脱下来,再将洗脱液进样于高效
液相色谱分析。薄层色谱-
气相色谱联用,将样品先在薄层上分离,定量收集欲测组分的斑点,经洗脱、浓缩、衍生化等步骤,注入
气相色谱仪再进行分离和鉴定。除此之外,薄层色谱还可与
原子吸收光谱、荧光光谱和光声光谱等联用。