主题：【第三届原创参赛】凝胶柱色谱——微生物转化、分离、纯化中的神来之笔

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liuliuhui

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发表于：2010/09/18 22:53:32 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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生物转化概况：
生物转化是指利用酶或有机体作为催化剂实现化学转化的过程，又称生物催化。
生物催化中常用的有机体主要是微生物，其本质是利用微生物细胞内的酶催化非天然有机化合物的生物转化，又称微生物生物转化。
微生物转化有许多优点：微生物生长速度快，转化时间短；微生物发酵工艺成熟，便于工业化生产。随着生物学科的进展，特别是固定化细胞，诱变和基因重组等重要生物技术的发展，微生物转化技术更加广泛地应用于药物及其前体化合物的制备，生物催化不对称合成，光学活性化合物的拆分，新药开发等领域。

本人研究内容：
本人主要利用微生物转化方法将某一黄酮类化合物（保密）在酶的作用下转化成多种产物，将转化产物与生物转化系统分开后，按化学方法将产物分离提纯。一般来说转化过滤液含有大量水，产物浓度较低，可采用有机溶剂萃取或浓缩等方法对转化产物进行富集。

出现问题：
萃取后的浓缩液进行液相分析所得图谱如下所示：
液相条件：流动相：甲醇/水：45% 流速：0.8ml/min
色谱柱：HYPERSIL C18(10μm,4.6×250mm) 柱温：40℃

图一

图二

如图所示：图一为空白转化液的萃取浓缩液
图二为给药后转化产物的萃取浓缩液

下图中箭头所示可能为转化产物的色谱峰，但与空白组对照起来似乎不太明显，这是因为在生物转化过程中会产生许多内源性物质，以至于将少量的转化产物“掩盖”起来，使我们不容易辨认出来。

问题解决：
因为内源性物质大多数都为大分子物质，分子量很大，与转化产物在分子大小上有很大差别（因为底物分子量很小，生物转化不能改变母核结构），所以根据Sephadex LH-20的分离原理可以将内源性物质与转化产物分开。经Sephadex LH-20后的液相图谱：

液相条件：流动相：甲醇/水40% 流速：0.8ml/min
色谱柱：HYPERSIL C18(10μm,4.6×250mm) 柱温：40℃

图三

如图所示，内源性物质经Sephadex LH-20后除掉了，色谱图也变得干净了，转化产物清楚地呈现在我们面前。（此图出峰时间与前面的不一致，是因为不是同一天做的，所以流动相比例不同，流动相配比不同也是为了使两个转化产物峰分离效果更好。及液相本身的误差使出峰时间有差异）

讨论：
1. 羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）分离原理：具有分子筛的特性，可按分子量大小分离物质外，在有极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中起到反相分配色谱的效果。
2.图二和图三转化产物的峰吸收不一致可能原因是空白中的物质与转化产物峰有所叠加造成的，当经凝胶过滤后除去杂质所以呈现出如图三所示的色谱峰。
3.做实验的过程中要根据自己样品的性质选择合适的分离手段，会起到事半功倍的效果哦！

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