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主题：【分享】高效液相色谱仪（HPLC）校正方法

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yifan1117
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发表于：2012/03/20 15:21:08 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
0.1      输液系统：

0.1.1    梯度误差GC不超过±3%

0.1.2    泵流量设定值误差 Ss＜±2%

0.1.3    流量稳定性误差  SR＜±2%

0.2      紫外检测器性能

0.2.1    基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU

0.2.2    定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5%

0.2.3    最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液

0.2.4    可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成)

1          校正条件

1.1      环境温度10-30℃，相对湿度低于65%

1.2      校正设备

1.2.1    秒表 分度值小于0.1 s

1.2.2    分析天平 最大称量200g,最小分度值0.1mg

1.2.3    容量瓶

1.2.4    微量注射器

1.3      标准物质和试剂

1.3.1    HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮

1.3.2    1×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液

1.3.3    紫外波长标准溶液

2          校正方法

2.1      梯度误差GC的校正

2.1.1    进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%，20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100%

Li：第i段信号值的平均值；    Lm­ ：各段输出信号平均值的平均值

可接受标准： -3%≤Gci≤3%

2.2      泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差SR的校正

2.2.1    将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25分钟，称重，按下式计算流动相流量设定值误差Ss和流动相流量稳定性误差SR。公式：Ss=（Fm-FS）/Fs 100%

可接受标准：-2%≤Ss≤2%

SR=（Fmax-Fmin）/F×100%

可接受标准：-2%≤SR≤2%

Ss：流量设定值误差（%）；    Fm=（W2- W1）/ρt.t：流量实测值（ml/min）

W2 ：容量瓶+流动相的重量（g）； W1：容量瓶的重量（g）； Fs：流量设定值（ml/min）；

ρt：实验室温度下流动相的密度（g/cm3）； t：收集流动相的时间（min）；

SR ：流量稳定性误差（%）； Fmax 为同一组测量中流量最大值（ml/min）；

Fmin：同一组测量中流量最小值（ml/min）； F 为同一组测量值的算术平均值（ml/min）

表一：Ss和SR的校正



流量设定值（ml/min）

1.0

1.5


测量次数

3

3


收集流动相时间（min）

15

10


允许误差

Ss

2％

2％


SR

2％

2％


2.3      基线噪声和漂移

2.3.1    选用C18的色谱柱，以波长254nm,流动相为100%甲醇，流速1.0ml/min，仪器稳定后记录基线30min，求基线噪声Nd。可接受标准：Nd≤5×10-4AU

2.3.2    基线漂移用1h内基线偏离原点的值（AU/h）表示。可接受标准：D≤5×10-3AU/h

2.4      最小检测浓度

2.4.1            以上述色谱条件下，进样20ul的1×10-7g/ml的萘甲醇溶液，计算最小检测浓度CL。公式：

CL=
2 Nd C×20

                          HV

Nd：基线噪声，mm；      C：标准溶液浓度，g/ml；

H：标准溶液色谱峰的峰高，mm； V——进样体积，ul。

2.4.2            可接受标准：CL≤1×10-7g/ml

2.5      定量测定重复性的校正

将仪器联接好，使之处于正常工作状态，波长254nm,流动相为100%甲醇，流速1.0ml/min,用萘的甲醇溶液连续进样6次记录下峰面积，按下式计算相对标准偏差：

n

RSD =  [∑（Xi- X ）2]/（n-1）×(1/ X )×100%

I=1

RSD：相对标准偏差（%）；  n：测量次数； Xi：第I次测量的峰面积

X – n次进样的峰面积算术平均值

可接受标准：RSD≤1.5%

2.6      波长示值误差

2.6.1            用注射器将紫外波长标准溶液（标准波长为235nm，257nm，313nm和350nm）从检测器入口注入样品池冲洗，并将池充满，将波长调到低于标准波长5nm处，到标准波长+4nm处，测得的最大吸收值处对应的波长与标准波长之差为波长示值误差；目前仪器可以在1ml/min的流量下，直接用空管连接检测器，每隔2min改变1nm，连续进标准样10ul，同样可得波长示值误差。

2.6.2    可调波长紫外可见光检测器波长示值误差 (此项只适用于HP1100高效液相色谱仪且带有HP工作站)。

2.6.3    打开HP1100液相色谱仪和HP工作站，打开输液泵和检测器，用纯水冲洗系统直至稳定，进入 Diagnosis窗口，点击氘灯图标，进入 show module tests状态，点击VWD VL calibration test 点击start ，系统自动进入校正状态，待校正完毕，将校正结果打印归档。

2.6.4    可接受标准：λ≤2nm

3                    性能确认

3.1      使用标准品或供试品，确认仪器性能符合使用要求；

3.2      先进行色谱柱的性能确认，内容包括：分离度，对称因子，理论塔板数和峰面积标准偏差。

3.3      液相色谱柱的确认

3.3.1    测试标准样配制：称量1000mg苯酚，100mg联苯加入到100ml容量瓶中，移入邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯各1ml，然后用甲醇定容到100ml，混匀，从中移取1ml该溶液，用乙腈：水=70：30定容至100ml。

3.3.2    方法：流动相为乙腈：水=70：30，流速为1.0ml/min,波长为254nm,温度为30℃，进样量为：10ul,运行10min。

3.3.3    色谱柱：Extend-C18 Analytical, 5um,4.6*250mm。

3.3.4            连续进行5次分析，分离度均R＞1.5；邻苯二甲酸二乙酯对称因子S在0.80～1.50范围内；邻苯二甲酸二乙酯柱效＞3000m-1；邻苯二甲酸二乙酯峰面积的标准偏差应≤1.5%。

3.4      按照性能确认方法逐步进行，并记录谱图； 根据性能测试的结果，评价仪器是否符合性能要求。

4                    校正结果处理和校正周期

4.1      校正结果全部项目均符合技术要求者，判为合格，方可使用。若某些指标达不到要求，关于仪器情况，仪器负责人以维修报告的形式报于QC经理，由QC经理批准维修方案。

液相色谱仪的校正周期为一年。
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happy爱米粒
xgy2005
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2012/3/29 21:03:17 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
几乎没有自己矫正过仪器呢，呵呵，都是专业的鉴定部门上门校正的
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yu3226033
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2012/3/29 21:13:15 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
正常使用多长时间校正一次?
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dahua1981
dahua1981
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2012/3/30 8:43:51 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我们是一年一次
都是外校
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yifan1117
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2012/3/30 9:30:03 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
正常是一年，其他的看自己要求!
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天天想你
littlejie
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2012/3/30 9:34:17 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一般都是仪器厂家工程师来弄的 自己弄了几回效果不好
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天天想你
littlejie
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2012/3/30 9:35:16 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
几乎没有自己矫正过仪器呢，呵呵，都是专业的鉴定部门上门校正的
是的 最好自己不要弄 还是找仪器工程师
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dahua1981
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2012/3/30 9:36:40 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 天天想你(littlejie) 发表:
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
几乎没有自己矫正过仪器呢，呵呵，都是专业的鉴定部门上门校正的
是的 最好自己不要弄 还是找仪器工程师

不用仪器工程师
计量部门就行
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天天想你
littlejie
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2012/3/30 9:44:17 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
原文由 天天想你(littlejie) 发表:
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
几乎没有自己矫正过仪器呢，呵呵，都是专业的鉴定部门上门校正的
是的 最好自己不要弄 还是找仪器工程师

不用仪器工程师
计量部门就行
哈哈 我们这计量的来就是贴计量合格标签 无实质性工作
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yifan1117
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2012/3/30 9:50:18 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
干嘛找仪器工程师呢？不是法定机构检测吗？
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yu3226033
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2012/3/30 9:55:28 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 天天想你(littlejie) 发表:
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
几乎没有自己矫正过仪器呢，呵呵，都是专业的鉴定部门上门校正的
是的 最好自己不要弄 还是找仪器工程师
一般维修时才校正.
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