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主题：【原创】【极限体验】维生素D3系统适用性溶液中一个未知杂质的来源探究

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fengmo4668
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发表于：2012/07/17 22:57:34 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
该帖子已被samanthalas设置为精华；
【背景】
上个月发了个关于维生素D3的体验（详情参见http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120629/4119572/主题：【原创】【极限体验】记一次维生素D原料的入厂检验），基本上很是满意。

做维生素D3的系统适用性时，药典上描述的是，经过高温和光照破坏，得到的前维生素D3峰、反式维生素D3峰，速甾醇D3峰，加上维生素D3主峰，一共为四个峰。但是我破坏后得到的却是五个峰。根据药典上得相对保留时间来核对，多了一个12.2min的峰（如下图）。



我的推测，可能是第二次高温光照时没有充氮，产生的VD3的降解产物。

Arvid建议我充氮保护一下，再做一次，验证会不会还出现12min的那个峰。

雪妖版主也指出，因为没有做溶剂空白，也不能排除是溶剂高温光照产生的。

因此，我这次就做了这个实验，来大概确认一下其来源。

【色谱条件】
仪器型号：Agilent 1260；检测器：DAD检测器；色谱柱：TopsilTM（拓谱）Silica Si 4.6*250mm 5μm；流动相：正己烷-正戊醇（997:3）；检测波长：254nm，流速：2 ml/min。

【实验设计】
有了上一次的实战经验，这次做的有点驾轻就熟。

因为上次光照的时间问题，这次有意识的延长了一段时间。

本次试验持续了两天。

第一天，只是单纯的想搞清楚12min的峰的来源，以及未充氮的可能影响。

但是最终结果不是很理想（结果部分有详细介绍）。因此在第二天的试验设计中，为了更好的搞清楚高温和光照以及不充氮对维生素D3各有什么样的影响，选择空白溶剂、充氮样品，未充氮样品进行对比，并把高温后未光照的样品作为一个监测点。

【试验结果】
第一天：
因为流动相为两种混合溶剂，特别是正戊醇含量特别少，每次配制流动相的细微差异可能会导致主峰保留时间的移动，因此先确定主峰的保留时间。
充氮及未充氮样品高温光照后的结果：

可以看到，12min处几乎没有峰。难道是上次的样品被污染出现的？为什么这次又没有踪迹了呢？奇怪！
但是，后面应该出现速甾醇的位置也没有峰。充氮和未充氮的谱图基本上没有什么差异，只是6min的地方多出一个峰，而且未充氮的更大一些。
肯定还是哪个地方有问题。或者，光照的强度不够？？因为我的紫外荧光仪是很老的设备了，灯管处的玻璃都出现锈蚀了。

第二天：
把昨天未倒掉的样品又经历了高温和光照的过程。检验结果见下图。

奇怪不？ 12min的峰及速甾醇都出现了，6min的峰倒快消失不见了！一头雾水啊！

重新称样品，一步一步的重新开始做。
基本可以判断溶剂与12min的峰没有任何关系！

然后是样品的结果：

果然，不管是充氮的，还是未充氮的样品，在经历了高温和光照后都出现了12min的峰。说明12min的峰是与维生素D3相关的物质！而且，只高温未光照，不管是充氮或者不充氮，均没有出现12min的物质，因此可以判定，其的出现，和光照有直接关系！

速甾醇（主峰后的峰）在高温未光照的充氮样品中没有出现，光照后出现，证明和光照相关；在高温未光照的未充氮样品也有出现，说明和氧气也有一定的相关性；而光照后的未充氮样品中速甾醇的峰高峰面积增大，则进一步确证其和光照是相关的！

【结论】
1.  确认保留时间在12min的峰不是溶剂高温或光照产生的。

2.  确认保留时间在12min是VD3的相关物质，并且与光照有关。

3. 速甾醇的产生，和氧气及光照均有关系。

4. 12min、14min、15min、19min、25min、30min的物质都是VD3的相关物质。
为何？
14min为前维生素D3，15min为反式维生素D3，30min为速甾醇，这是中国药典上规定的，不必解释。19min和25min是VD3样品中（参见维生素D3的有关物质检验谱图，http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120629/4119572/主题：【原创】【极限体验】记一次维生素D原料的入厂检验），12min也已经确认是维生素D3的光照产物。
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fengmo4668
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2012/7/17 23:48:53 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
【讨论】
1.  第一天的样品中， 6min的物质是和谁相关的呢？
其在样品和溶剂中没有出现，但是高温光照后出现。且未充氮的样品比充氮样品的峰高要高些。
第二天再重新高温光照样品，6min物质又几乎消失。
难道是我的进样小瓶不干净？？？

2.  12min、14min、15min、19min、25min、30min的物质都是VD3的相关物质。那为何药典上之规定了14min.15min和30min，而对12min、19min、25min视而不见，不做规定呢？
我的推理是，因为14min与15min（与主峰的相对保留时间分别为0.5和0.6），维生素D3和30min的物质（与主峰保留时间为1.1）分别是极性最相近的物质（由色谱柱的保留时间也可以判断出），如果其两两之间分离度可以达到要求，12min、19min、25min的物质的分离度自然不在话下，肯定能满足分离度要求。也即是说，控制住以上两对物质的分离度，所有物质的分离度就都控制住了。因此药典上未对其他有关物质作规定。

此推论理由对否？

欢迎赐教！
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2012/8/3 20:15:11 Last edit by fengmo4668
happy爱米粒
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2012/7/18 7:00:27 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
fengmo实验室能做所有的维生素吗？这么晚了还在熬灯苦战，辛苦了！
ps：系统适用性到底该如何验证呢？
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dahua1981
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2012/7/18 8:27:55 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
风魔这段时间一直在做维生素吗
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fengmo4668
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2012/7/18 10:04:38 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
fengmo实验室能做所有的维生素吗？这么晚了还在熬灯苦战，辛苦了！
ps：系统适用性到底该如何验证呢？


药典上有专门的规定。
就是把一个目标物A，经过一系列的破坏试验，让其产生出于目标物A相关的各物质，可能为B、C、D.......等等几个或更多个物质。

然后试你的色谱条件。在该色谱条件下，所有物质必须达到正常分离。也就是说，各有关物质对你的目标物均不会干扰。此时，你的液相系统适用你的样品检测。
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fengmo4668
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2012/7/18 10:05:04 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
风魔这段时间一直在做维生素吗


是。采购了基本上能买到的所有维生素了。
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dahua1981
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2012/7/18 10:08:53 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 fengmo4668(fengmo4668) 发表:
原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
风魔这段时间一直在做维生素吗


是。采购了基本上能买到的所有维生素了。
不是只为了原创吧
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fengmo4668
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2012/7/18 11:04:28 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
原文由 fengmo4668(fengmo4668) 发表:
原文由 dahua1981(dahua1981) 发表:
风魔这段时间一直在做维生素吗


是。采购了基本上能买到的所有维生素了。
不是只为了原创吧


怎么可能，我有钱也不能这样子糟蹋呀！更何况我还没有钱呐！

是我们项目要用的。
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happy爱米粒
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2012/7/18 12:05:08 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 fengmo4668(fengmo4668) 发表:
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
fengmo实验室能做所有的维生素吗？这么晚了还在熬灯苦战，辛苦了！
ps：系统适用性到底该如何验证呢？


药典上有专门的规定。
就是把一个目标物A，经过一系列的破坏试验，让其产生出于目标物A相关的各物质，可能为B、C、D.......等等几个或更多个物质。

然后试你的色谱条件。在该色谱条件下，所有物质必须达到正常分离。也就是说，各有关物质对你的目标物均不会干扰。此时，你的液相系统适用你的样品检测。


谢谢解答，了解了，这类验证貌似很费时费力，此适用性验证是必须要做的吗？
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fengmo4668
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2012/7/18 12:16:32 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
原文由 fengmo4668(fengmo4668) 发表:
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
fengmo实验室能做所有的维生素吗？这么晚了还在熬灯苦战，辛苦了！
ps：系统适用性到底该如何验证呢？


药典上有专门的规定。
就是把一个目标物A，经过一系列的破坏试验，让其产生出于目标物A相关的各物质，可能为B、C、D.......等等几个或更多个物质。

然后试你的色谱条件。在该色谱条件下，所有物质必须达到正常分离。也就是说，各有关物质对你的目标物均不会干扰。此时，你的液相系统适用你的样品检测。


谢谢解答，了解了，这类验证貌似很费时费力，此适用性验证是必须要做的吗？


必须要做。
不然，你不知道你的检验结果是否准确。
一般，系统适用性试验适用于在主峰保留时间附近有别的物质，可能会干扰到主峰的测定的情况时。

理论上，每次配制流动相后，都要做系统适用性试验。
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happy爱米粒
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2012/7/18 12:29:10 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 fengmo4668(fengmo4668) 发表:
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
原文由 fengmo4668(fengmo4668) 发表:
原文由 木有才(xgy2005) 发表:
fengmo实验室能做所有的维生素吗？这么晚了还在熬灯苦战，辛苦了！
ps：系统适用性到底该如何验证呢？


药典上有专门的规定。
就是把一个目标物A，经过一系列的破坏试验，让其产生出于目标物A相关的各物质，可能为B、C、D.......等等几个或更多个物质。

然后试你的色谱条件。在该色谱条件下，所有物质必须达到正常分离。也就是说，各有关物质对你的目标物均不会干扰。此时，你的液相系统适用你的样品检测。


谢谢解答，了解了，这类验证貌似很费时费力，此适用性验证是必须要做的吗？


必须要做。
不然，你不知道你的检验结果是否准确。
一般，系统适用性试验适用于在主峰保留时间附近有别的物质，可能会干扰到主峰的测定的情况时。

理论上，每次配制流动相后，都要做系统适用性试验。


也就是走梯度空白？
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