主题：【第六届原创】二极管阵列检测器与峰纯度分析

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发表于：2012/10/15 07:59:59 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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二极管阵列检测器与峰纯度分析

1引言

在药物色谱分析方法开发过程初步完成后，需要对分析方法进行验证，验证的内容包括定量限，精密度和专属性等内容…一些人认为分析方法的专属性是首选必须明确的验证项目，如果分析方法专属性不够，最终会影响准确度等验证内容，得出错误的结论。除了传统的验证专属性的方法外，峰纯度（Peak Purity）检查越来越多的用于评价方法的专属性，可以提供峰纯度的检测器有多通道紫外可见光检测器，二极管阵列检测器（DAD）和质谱(MS)。目前一般药物实验室都配备有二级管阵列检测器，在多种资料和国内药物分析培训中，建议在使用二极管阵列检测器做峰纯度分析时候，主峰的纯度因子应大于980。实际上，该建议的纯度因子及其相关参数表述是安捷伦（Agilent）色谱工作站光谱部分采用的峰纯度检查表现形式，别的色谱工作站会采取不同的表现形式，如waters的化学工作站采取计算峰纯度角与阈值角来比较峰纯度的。下面我们以安捷伦的chemsation中光谱选项涉及到的相关参数和处理过程为例讨论二极管阵列检测器与峰纯度分析过程。

2评估峰纯度的原理

不同的化合物具有不同的形状的光谱（这里讨论的是紫外-可见光光谱图），在光谱上不同波长比值是一定的，如果色谱峰是均匀的同一种物质，那么在色谱峰流出的各个时间点，不同波长的比值是一定的[1]。图1显示的是同时检测两个波长（信号A和信号B）的色谱图，下图显示的是两个波长（A/B）的比值图。纯的色谱图比值是恒定的，显示为一条直线，不纯的比值图是有波动的。

图1[2]

如果用双波长检测器，同时检测两个波长并绘制比值图就可以评价峰纯度了，问题是选择那两个波长呢？如果选择的其中一个波长几乎没有吸收呢？只选择两个波长比值来评价整个峰纯度足够吗？有没有更加优化的办法呢？二极管阵列检测器可以解决上述问题。二极管阵列检测器可以实时提取色谱流出物的光谱，并采用合适的算法比较色谱峰每个时间点的光谱图，这远比比较光谱图上两个波长点更加准确和可行。下面我们讨论二极管阵列检测器考察峰纯度的过称（以Agilent为例）。

3二极管阵列检测器和分析峰纯度的方法

二极管阵列检测器与普通的紫外-可见光检测器的最大构造不同是不对穿过检测池的进行分光。二极管阵列检测器在检测池的后方分光，全波段的光到达二极管阵列并产生信号。二极管阵列检测器可以实时获得检测池物质的紫外-可见光吸收光谱图，这是普通紫外-可见光检测器无法完成的。基于二极管阵列检测器以上特性，安捷伦的chemstation 采用两种方式显示峰纯度：（1）光谱归一化法；（2）光谱相似曲线。[1]
光谱归一化法比较简单，选取色谱图上的3-5个点（这些点一般是峰开始，峰上升，峰顶点，峰下降，峰结束等色谱峰对称的几个点，因为二极管阵列是实时获取光谱图，当然你可以在色谱上选择更多的点），提取这些点的光谱图，把这些点的光谱图叠放，吸收值归一化，看这些光谱图是否重合，从重合的程度来判断峰的纯度。图2显示的是光谱归一化法评价色谱峰纯度，保留时间7.8min的色谱峰光谱图不能完全重合，显然该色谱峰是不纯的。

图2[2]

光谱归一化法直观，与其相比光谱相似曲线从计算相似因子入手，绘制相似曲线，评价峰纯度过程更加精细化，相似因子引入了量化指标。我们来看看相似因子的计算过程，首先把获得的光谱向量阵列化表示;在色谱图A时间点光谱表示为（A1(λ1), A2(λ2)…An(λn)），在B时间点(（B1(λ1), B2(λ2)…Bn(λn)）,A1为在波长λ1的吸光度，B1为在波长λ1的吸光度,以此类推…如果A点和B点的光谱相同的，他们表现为A与B的数值大小不同但比值一定（参见2评估峰纯度的原理），即A与B向量方向是一致或者相反的，那么他们在空间的角度为0或者180度，cos值为±1。公式1是计算cos值r的过称，依次计算各个波长，从而把整个光谱计算一遍，为了数值比较方便，相似因子采用的是cos值r平方的1000倍（公式1和2）。

在实际分析过程中，软件选取软件默认的色谱点或者操作者指定的色谱峰上光谱提取点的光谱图进行计算比较，在色谱峰的起点和终点，因为末端吸收和噪音影响，光谱图会有一定的畸变，所以要选取阈值。安捷伦会计算整个色谱峰流出过称的相似因子并考虑噪音影响（计算阈值），把这些值用线连接起来就是相似曲线和阈值曲线，并且会用不同颜色区分纯度因子设定值（图3），如：以990为界，低于990为红色，并显示在相似曲线上方，而在下方为大于990的绿色区域。如果有相似因子点落在红色区域，峰纯度不通过。出现这种情况，你可以减小设定值，如980，或者初步判断是色谱方法专属性不好。接下来我们简单讨论一下影响峰纯度相似曲线计算的因素。

图3[2]

4影响峰纯度评价的参数因素和实践举例

看完了上文枯燥的理论部分，提高评价峰纯度的准确性应该考虑以下因素:

1优化积分参数，斜率和峰宽用来识别峰的起始和结束，这两个点是纯度检查中光谱检查的重要点。安捷伦默认的5个点（图4图5）包括这两个点。

2对二极管阵列检测器扫描波长的考虑。因为流动相截止波长的影响，一般最好不要从210nm（安捷伦默认）采集波谱，光谱归一化中低波长区重合度比较差（图4）。

3考虑噪音影响。设置适当的噪音水平会得到比较满意的结果（图4图5）。

图4

图5

5结论

越来越多的药物分析实验室配置了二极管阵列检测器，药物分析相关指导中对二极管阵列检测器的评价分析方法专属性----分析峰纯度做了一些指导。在这里我们比较详细的从原理，处理过程介绍了二极管阵列检测器评估峰纯度的方法，并简单的讨论了影响因素，举了一个小例子，希望对大家有所帮助。

[1]H.-J. P. Sievert and A. C. J. H. Drouen, Spectral matching and peak purity in

Diode-Array Detection in High-Performance Liquid Chromatog-raphy , 1993,

[2]安捷伦相关仪器手册。

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