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主题：【第六届原创】液相色谱进样量和进样体积的对柱效影响

浏览0 回复71 电梯直达

houcai

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发表于：2012/11/04 19:09:58 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

该帖子已被czj_1027设置为精华；

维权声明：本文为houcai原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

前言：
按照10版药典方法检测乳糖的含量，按照系统适应性下的要求，乳糖与蔗糖达到分离要求，乳糖的理论踏板数不小于5000。下面主要考察乳糖在测试过程中，相同样品浓度下不同的进样体积对柱效的影响和不同浓度下相同进样体积对柱效的影响。
测定方法：

色谱柱：Ultimate®XB-NH2-3，4.6×250mm，5μm；

温度：柱温：45度，示差检测器：40度；

流动相：乙腈-水=70：30；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL。

样品配制：

系统适用性：精密称取乳糖0.0255g和蔗糖0.0254g置于25ml容量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇匀，过滤，即得。

含量测定样品溶液：精密称取样品粉末0.0252g于25ml容量瓶中，用水溶解并定容，过滤即得；

含量测定对照品溶液：精密称取对照品粉末0.0254g于25ml容量瓶中，用水定容，过滤即得

按照测定要求，按照测定要求样品浓度为1mg/ml，进样体积：10ul考虑到我的仪器的定量环是20ul，因为是手动进样，进样量10ul可能在计算含量的时候峰面积不稳定计算会产生误差。

考虑把样品浓度配制成0.5mg/ml，调整进样体积为20ul；
下面上一张系统适用性图：

重复了好几针，分离度和保留时间没改变，柱效依然达不到5000.
乳糖对照品0.5mg/ml 进样量20ul

测试乳糖对照品，乳糖的柱效也是比较低的。
考虑到示差检测器是比较难稳定的，也考虑氨基柱在平衡中是比较难平衡的，所以采用过夜循环平衡方法进行测定。
测试乳糖对照品0.5mg/ml 进样量20ul

平衡了一夜但的柱效一点都没有改善。柱效依然不能满足要求。
这个过程考虑到是否是氨基柱的问题，排除了氨基柱在使用过程中的氨基脱落导致柱效的原因，为了排除色谱柱的原因换新柱子测试，柱效还是不能满足要求。
百思不得其解中，想到样品质量对柱效影响，还是进样体积对柱效是否有影响。为了证明是相同质量下，不同进量是否对柱效存在影响。下面配制1mg/ml的浓度分别进样20ul和10ul的体积。

乳糖对照品1.0mg/ml 进样量20ul

乳糖对照品1.0mg/ml 进样量10ul

进样体积减少10ul发现柱效提高一倍多。

结论：从以上实验结果分析比较当乳糖含量样品体积为20ul，样品浓度1mg/ml，柱效：3982；0.5mg/ml,浓度，柱效4253；当乳糖浓度1mg/ml的浓度进样为20ul柱效：3982；进样量10ul柱效：8413，进样体积减小一半，柱效提高一倍。
说明在夜想色谱柱具有一定的饱和容量下，最大进样体积，也要决定于化合物在固定相和流动相中平衡，通过上面实验证明，随着进样量的增大，柱效降低。当进样量超出色谱柱饱和容量时，柱效也会降低。对于一定的样品量，进样体积增大，柱效降低。当进样量超出色谱柱上样最大进样体积时，柱效会有明显降低，影响分离结果。
当然对于分析色谱而言，所需要的进样量和进样体积都是很小的，所以在平时很少观察到这点现象。可以看出进样量和进样体积对定性定量中对色谱柱柱效的影响。

发现晚上传图太慢了，所以今天晚上才把图传上来，供各位色友分享。

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2012/11/4 19:26:50 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

不错的原创。

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阿三

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ID：junqiwudi

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2012/11/5 12:56:37 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

以前虽知道这样的理论但今天是活生生的看到了

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雪妖

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ID：czj_1027

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2012/11/5 13:44:16 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

楼主考虑问题很细心，实验验证过程也很周全，进样体积往往是我们容易忽视的问题，理论上来说10ul，20ul在楼主用的这个规格的柱子上面都不会过载，但是溶解了不同的样品效果就不一样了，还有一个项目就是安乃近也是这样的，药典要求的10ul进样后柱效很低，进5ul柱效就会很高，希望楼主以后有这样的信息多和大家分享
周末还发帖，楼主辛苦了O(∩_∩)O~

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samanthalas

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2012/11/5 13:50:56 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

通常所说的"进样量", 一般指的是进样的体积,还是进样的样品的质量呢?

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dahua1981

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2012/11/5 13:53:41 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

支持原创

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samanthalas

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2012/11/5 14:08:52 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我以前也遇到一个用户跟我反映类似的问题:
他做的样品是噻虫嗪,方法完全按照国标.一开始他的进样体积是20微升,出现平头峰以及拖尾现象.
他把谱图发过来,我们工程师告诉他进样量过载了.客户就把20微升改成3微升,还是拖尾.
我们就跟他说,光是进样体积减小没有用,浓度也要减小.
但是用户说,必须完全按照国标方法来.

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