主题：【讨论】图文讲座第233期：实时细胞分析技术在肿瘤研究和病毒抗体疫苗检测中的应用

实时细胞分析技术原理

1.从传统终点检测到实时无标记检测
    细胞活性检测是细胞生物学研究的重要内容，其广泛应用于生物活性因子测定、细胞增殖检测、大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性检测等研究。
    传统细胞活性检测方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法以及ATP检测法等。但这些细胞学研究检测形式多是终点检测法，仅给实验提供一个最终结果，且经常需要标记和破坏细胞。由于细胞是活体，其生物学和细胞进程是动态而非静态的，终点检测法大大局限了生物信息的全程动态收集。
为了克服终点检测方法的局限性，ACEA Biosciences开发出了一项全球领先的实时无标记细胞分析技术，并研发出一系列实时无标记细胞功能分析仪。该方法最重要的特征是检测过程无标记、对细胞无创伤性，因此可以长时间持续检测细胞状态、以及由化合物和其他因子介导的细胞生物学反应。

图1. 传统终点检测方法到实时无标记检测方法

2.实时细胞分析技术原理
    实时无标记细胞分析技术，采用特殊工艺，将金微电极阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部，用于构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测系统。当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时功能状态改变呈相关性，通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物信息，包括细胞生长、延伸、形态变化、死亡、贴壁等。

图2. E-plate 底部的交叉微电极工作原理示意图。贴壁生长的哺乳动物细胞与微电级间的相互作用产生的阻抗与孔内的细胞数量、细胞形态以及细胞黏附质量相关；阻抗的大小用细胞指数（CI）进行衡量。

3. 实时细胞分析技术优势
    传感器阻抗技术在细胞分析中的应用具有其特有的优势。第一个也是最重要的，细胞传感器阻抗为整个实验全程包括细胞粘附、增殖和融合提供了全程无损伤性的细胞监控。实时的监控为同一个实验中和不同实验间的细胞提供了出色的质量控制。另外，因为有了实时、连续显示的数据，就可以更自信地操作和处理细胞，而不是假定细胞处于合适的处理阶段。有了阻抗读数以及实时获取和显示的数据的特性，每一步处理结果都可以通过机理来预测。最后，因为读数是非损伤性的，传统的终点分析仍然可以继续结合阻抗读数来决定进行传统终点分析的最佳时间点。

表1. RTCA技术检测优势

实时细胞分析技术平台产品简介

    基于实时细胞分析技术，ACEA研发出一系列实时无标记细胞功能分析仪，帮助研究人员克服传统终点检测法的局限性，实时动态检测细胞状态。该平台产品已在南京大学、复旦大学、中山大学、解放军第302医院等全国多家单位的实验室中帮助科研人员进行细胞增殖检测、细胞毒性检测，以及抗肿瘤药物筛选的研发生产等研究领域。

表2. 实时无标记细胞分析平台系列产品

   

实时细胞分析技术作为一种新兴的细胞活性检测技术，可广泛应用于细胞生物学、分子生物学、肿瘤学、生物化学、毒理学等多种学科领域及抗肿瘤药物筛选、研发、生产及质量控制过程。下面我们将以应用实例展示的形式为大家简单介绍RTCA技术在肿瘤、药物细胞毒性检测领域，以及在病毒、细胞毒素、中和抗体及疫苗检测与评估领域的应用。

实时细胞分析技术在肿瘤、药物细胞毒性检测领域的应用
       
    细胞活性检测常运用在细胞功能、细胞对药物反应以及药物毒性的研究。新的药物、化妆品、食品添加剂等在投入之前，都必须进行大量的细胞毒性检测。如果是抗癌药物，细胞毒性就是它们作用的的关键所在，因此细胞毒性检测实验也随研究目的不同而不同。RTCA实时细胞分析技术通过电阻抗的形式，可以实现实时、无标记、持续动态检测细胞表型变化。此外，在药物细胞毒性检测实验中，RTCA检测能够精确确定化合物介导的细胞毒作用发挥最大效应的时间点，帮助研究人员更好的控制和优化实验，有助于抗肿瘤药物筛选以及药物作用机理的研究和揭示。

应用实例一：RTCA实时动态细胞毒性检测
       
    RTCA实时细胞分析技术持续动态监测细胞贴壁、伸展及细胞增殖过程。使用细胞指数（Cell Index）表示细胞阻抗。每点CI值定义为（Rn-Rb）/15，其中Rn表示孔接种有细胞时的背景阻抗值，Rb是表示孔中只有培养基时的背景阻抗值。标准化细胞指数（NCI）定义为感兴趣的时间点的细胞指数与某一特定时间点的细胞指数的比值。
    实时细胞分析技术能够实时、连续检测细胞的活力。图3A为几种抗肿瘤药物（DNA损伤药物阿霉素Doxorubicin和5-FU，蛋白酶体抑制剂MG-132及抗有丝分裂药物长春新碱Vincristine）的动态细胞检测图谱，图3B为采用WST-1进行药物细胞毒性检测的结果。RTCA实时细胞分析技术的检测曲线显示，不同作用机制的化合物介导的细胞增殖抑制速率和动力学具有明显的差异（图3A）。其中，MG-132介导的细胞毒素作用开始于加药4h，10h达到最大毒性作用；与此相反，长春新碱在加药后立即引起毒性作用，15h达到最大效应；而阿霉素和5-FU介导的细胞毒素作用在加药很长一段时间后才观察到，起效时间分别为12h和24h，药物作用48h后才观察到最大效应值。

图3A. RTCA实时动态检测细胞活力。 Hela细胞接种于E-Plate 96电极板，培养24h之后用不同化合物处理：MG-132（3.3uM），阿霉素（0.33uM），长春新碱（6.2nM）及5-FU（11.1uM），未经化合物处理的细胞作为对照组。每隔15min检测一次细胞指数，持续检测64h。曲线代表所有重复样品的平均值，误差线为标准偏差。图3B. 细胞指数和WST-1分析结果对比。实验结束时（图3A所示），即加药后64h，加WST-1染色分析。细胞指数和WST-1分析结果对比，结果展示为试验组相对于对照组的倍数变化，柱状图显示所有重复样品的平均值，误差线为标准偏差。

   

    为评估细胞指数变化是否可用于帮助选择后续检测的最佳检测时间点，我们选择了两种具有不同细胞动力学图谱的凋亡诱导药物MG-132和5-FU进行检测（图4）。Hela细胞接种于E-Plate 96培养24h后，将上述两种药物3倍稀释后加入到细胞中。RTCA持续检测64h，MG-132在加药后10h内出现CI最低值（图4A），而5-FU达到最低值则至少需要48h（图4B）。另外，细胞作用动力学图谱显示药物作用具有浓度依赖性，高浓度药物对细胞的作用效应更明显，细胞指数下降速率较快，而低浓度药物的细胞指数下降速率较慢（图4B）。同时，我们分别选取两个不同的时间（图4A 4B）。用凋亡实验进行检测的结果显示，对于MG-132，凋亡反应时间最佳剂量依赖时间出现在加药后16h而非在64h（图4C）；而对于5-FU，在16h，此时CI值刚开始出现下降趋势则无法测得凋亡效应，凋亡反应时间最佳剂依赖反应时间出现在64h（图4D），这说明凋亡反应具有瞬时性，同时也说明在捕获瞬时细胞反应时挑选最佳时间的重要性。根据上述RTCA获取的数据，进行凋亡检测试验时，应取CI值刚达到最低值时的时间点为佳，检测时间过早或过晚都无法捕捉到凋亡效应的最佳窗口。建立了最低细胞指数与凋亡作用之间的关系之后，我们又研究了如何根据细胞指数变化来预测细胞凋亡作用。

图4. RTCA实时检测细胞凋亡。Hela细胞分别用不同剂量的蛋白酶体抑制剂MG132（图A和图C）和DNA损伤抑制剂5-FU（图B和图D）处理，持续检测细胞指数64h。E-Plate 96电极板检测的同时，平行实验使用常规细胞凋亡方法进行检测。加药后16h和64h分别收集细胞，用ELISAPLUS细胞凋亡检测试剂盒，其结果显示为药物组相对于对照组的比值。

图5. RTCA检测指示最佳检测时间。（A）Hela细胞用3.3uM MG-132处理后，细胞指数持续检测12h；（B）RTCA检测和传统终点WST-1检测的对比；（C）ELISAPLUS检测加药后1,4,8,12h的细胞凋亡。

   

    在该研究中，我们使用了具有较快反应动力学的药物MG-132。加药后持续检测细胞指数12h；同时设立平行试验，使用WST-1细胞增殖检测试剂和ELISAPLUS细胞凋亡检测试剂盒检测药物作用1,4,8,12h的细胞凋亡现象（图5）。当细胞指数接近最低值时可观测到最高水平的细胞凋亡效应（图5C），重要的是，与WST-1分析法相比，细胞指数变化能更灵敏的预测细胞凋亡效应（图5B）。例如，在加药后8h，指数显示与对照组相比，实验组细胞指数发生了>80%的变化，而WST-1分析法则只显示发生了<20%的变化，相应的，在该时间点细胞凋亡作用非常明显，为对照组的6倍。因此，检测化合物引起的细胞黏附、形态等快速瞬时变化，与传统的检测线粒体功能的WST-1终点检测法相比，更适合用实时细胞分析技术进行检测。实时细胞分析技术检测细胞瞬时反应的高灵敏性特性，也非常适用于指示后续实验的最佳检测时间点，从而帮助研究者更深入的揭示化合物介导的细胞凋亡效应。

应用实例二：肿瘤与微环境之间的相互作用RTCA实时动态检测
       
    肿瘤与微环境的相互作用是近年来肿瘤细胞学研究的一个热点，不仅对肿瘤本身的发生发展和转移等研究有着非常重要的意义，而且对抗肿瘤药物筛选和肿瘤治疗起着相当重要的作用。
    检测肿瘤和微环境之间相互作用的传统细胞学方法是共培养的终点法，将肿瘤与基质细胞共培养一段时间后，染色后用显微镜来观察效应细胞对应答细胞的作用效果或是通过WST等方法检测应答细胞的生长情况。而这两种方法由于灵敏度不高，且检测的时间不易把握，因而具有一定的局限性。
    艾森生物开发的细胞共培养（CCD）系统是以艾森的实时细胞分析技术为基础，由E-Plate和ins ert两部分组成。贴附于E-Plate中的细胞，其贴附能力及相互作用都会导致阻抗的变化；同时，阻抗的变化与贴壁细胞的数量，大小，形状变化都有关系。如图6所示，在E-Plate中接种应答细胞，ins ert中接种效应细胞，ins ert中的效应细胞通过分泌影响应答细胞的生长因子等物质，对E-Plate中的应答细胞产生刺激，毒性或调解作用等。这些作用引起E-Plate中应答细胞发生增殖、形态变化、死亡等现象，从而引起电阻抗变化，并通过实时细胞分析技术进行实时检测，并且通过细胞指数的测定定量计算刺激的产生效果。ACEA实时细胞分析 CCD系统使动态监测肿瘤及肿瘤微环境之间的相互作用成为可能，而且，这种检测无需对应答细胞进行额外的标记。

图6. 细胞共培养系统（CCD）的结构示意图

动态检测C-Met及HGF介导下的肿瘤细胞Hcc827对Gefitinib的耐受
    利用ACEA实时细胞分析系统的CCD产品检测C-Met及HGF介导下的肿瘤细胞Hcc827对Gefitinib的耐受。在E-Plate板的每孔中接种Hcc827细胞作为应答细胞，MRC-5细胞作为效应细胞接种在ins ert中，可分泌生长因子HGF，同时按实验设计加入EGFR抑制剂Gefitinib和/或C-Met抑制剂Crizotinib，动态监测MRC-5细胞介导的Hcc827细胞对药物的耐受过程。如图7B中NCI Curve所示，正常生长情况下的Hcc827的曲线为红色；Hcc827细胞中加入抗肿瘤药物Gefitinib后Hcc827的生长受到明显的抑制（绿色曲线）。如图7C所示，Gefitinib处理并加入接种MRC-5细胞的ins ert，ins ert中的MRC-5细胞分泌的HGF通过cMET通路刺激Hcc827细胞的增殖，引起了Hcc827细胞对药物的耐受性（绿色曲线）。图7D所示，在图5C实验的基础上，加入cMET通路的抑制剂Crizotinib，阻断了HGF的作用，Hcc827细胞对Gefitinib的敏感性重新恢复（绿色曲线）。细胞染色图片与曲线所显示的结果一致。总之，ACEA实时细胞分析系统是目前唯一一种不需要对应答细胞进行标记或添加任何化学指示物就能够实时直接检测肿瘤与微环境之间相互作用的方法。该系统可以动态监测肿瘤与微环境之间相互作用的全过程，这是基于标记的终点分析法无法达到的。

图7. 动态检测成纤维细胞MRC-5介导的肿瘤对治疗的耐受

动态检测C-Met通路影响EGFR抑制剂耐药性与终点法的对比

图8. 动态检测与终点法检测成纤维细胞介导的肿瘤细胞对治疗的耐受性对比。（A）使用RTCA方法检测得到的细胞指数在96h的数值对比；（B）使用终点法在96h进行WST-1检测，得到的WST-1读数的对比。

    对比ACEA实时细胞分析系统检测和终点法检测的最终结果，图8A显示的是实时细胞分析系统动态检测法在实验结束时（96h），以细胞指数为纵坐标，显示了各个条件下Hcc827细胞的生长状态。图8B显示的是终点法使用WST-1检测的Hcc827细胞的生长状态，以WST-1的读数为纵坐标。两种方法得到的结果趋势基本一致，且使用实时细胞分析方法得到的结果灵敏度更高，加入药物的反应更加敏感。

RTCA技术在病毒、细胞毒素、中和抗体及疫苗检测与评估领域的应用

    微生物和病毒通过感染宿主细胞改变宿主细胞的生理功能，进而导致了疾病的发生。对病原体感染细胞的分析除了作为一个重要的感染诊断结果，还可以为我们提供关于微生物-宿主和病毒-宿主之间相互作用功能性评估的重要信息。迄今为止，虽然已经开发了多种基于细胞分析的微生物和病毒感染诊断方法，但却几乎没有一个平台的技术是专门用于此目的的。而且大多数分析方法的结果是定性的而无法定量，并且诊断的敏感性和准确性还有待提高。因此，我们迫切需要一种定量的、多功能的、快速的、且易于使用的细胞分析系统，而艾森生物研发的实时细胞分析技术正是集这些特点于一体的新型细胞分析技术。下文我们将介绍该技术在微生物和病毒感染中的应用，包括细胞毒素检测、细菌与宿主细胞之间相互作用检测、病毒介导的CPE定量分析、中和抗体检测、寄生虫感染活动的评估和免疫系统功能检测。

应用实例一：RTCA实时动态检测病毒Cytopathic Effect效应
       
    病毒引起的细胞病变作用Cytopathic Effect（CPE）是评价病毒的感染力及致病效应的通用方法。目前研究病毒的最常用方法是空斑实验。空斑实验的结果是来自于终点法检测，因此无法获取病毒复制及其引起的细胞病变的完整信息，此外，空斑实验过程中人工操作步骤过多，增加了操作人员感染病毒的风险。RTCA实时细胞分析技术可用于细胞增殖检测、细胞黏附及细胞活性检测等。因此，RTCA实时细胞分析技术的应用领域非常广泛，涉及新药研发、毒理学、肿瘤学、医学微生物学及病毒学等。同时该方法还可应用于细胞增殖及细胞毒性检测、细胞黏附和伸展、细胞质控、酪氨酸激酶受体反应、肥大细胞活化及G蛋白偶联受体激活等实验中。
    本应用案例讲述了通过RTCA实时细胞分析技术研究病毒介导的CPE效应的实验方法。此方法克服了传统终点法的限制，无需标记，步骤简单，且实时记录病毒CPE效应，成为研究病毒CPE效应的一种简便有效的方法。
    本实验使用实时细胞分析技术进行细胞增殖检测，并由此确定滴加病毒的最佳时间点，从结果中可以发现Vero E6细胞的最佳感染时期为细胞接种后20.5h，HEK293则在细胞接种后68.5h（图9A，B），在这个时间点接种密度为50000个/孔的细胞处于平台初期，接种密度为12500个/孔的细胞处于对数生长期。选择这两个时间点可分别观察病毒对增殖平台期和对数生长期细胞的不同影响。

图9. 动力学监测细胞增殖情况。细胞接种于E-Plate 96孔板后置于RTCA实时无标记细胞功能分析仪实时动态监测细胞增殖状况，并确定加入病毒的时间（细胞生长对数期或平台期）。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每30min检测一次（A）Vero E6细胞及（B）HEK293细胞黏附伸展及增殖状况。不同颜色的曲线代表不同的细胞接种密度。

    通过RTCA实时细胞分析技术实时动态检测细胞状况，发现Vero E6细胞无论在增殖平台期还是在对数生长期用高低两个滴度的病毒处理细胞都能产生CPE效应。当Vero E6在对数生长期感染病毒，病毒的CPE效应与病毒接种的滴度呈明显的相关性（图10）。在VSV病毒以较低的滴度（80,000 PFU）感染细胞，在感染期的15h Vero E6细胞的生长状况（图10A，蓝色曲线）与对照组类似（图10A，绿色曲线），但之后VSV病毒开始复制并诱导了细胞的死亡，表现为CI值下降，24h后CI值下降到50%（CI50），并持续下降，最后降为0，细胞全部死亡。若VSV病毒以较高的滴度（800,000 PFU）感染细胞，CI值在感染后4h就有所下降，在感染后11h下降到CI50。
    VSV病毒在Vero E6细胞生长平台期感染与细胞生长对数期感染的结果类似（图10B）：VSV病毒以较高的滴度（800,000 PFU）感染细胞，10h后CI值下降到CI50（图10B，红色曲线），VSV病毒以低滴度（80,000 PFU）感染细胞，19h后CI值下降到CI50（图10B，蓝色曲线），最后CI值也下降为0，细胞尽数死亡。

图10. 实时监控VSV病毒感染后Vero E6细胞的生长状况。（A）对数生长期细胞标准化CI值；（B）平台期细胞标准化CI值。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每15min检测一次VSV病毒对Veri E6细胞黏附伸展及增殖的影响。

    根据实时细胞分析技术检测到的细胞增殖曲线，选择HEK293细胞接种后68.5h滴入病毒（图11A，B）。感染VSV病毒后HEK293细胞与Vero E6细胞的反应不一致。HEK293在细胞对数生长期对病毒的作用非常敏感：高滴度的VSV病毒作用细胞后细胞CI值下降到CI50只要6h（图11A，红色曲线）；低滴度病毒组细胞CI值下降到CI50也只要12h（图11A，蓝色曲线）。然而，VSV病毒在细胞生长的平台期感染细胞的结果却完全不同（图11B）。高滴度病毒在细胞增长平台期感染细胞CI值变化的趋势和细胞对数生长期感染细胞的结果一致（图11B，红色曲线）；而低滴度病毒接种于平台期细胞时，细胞CI值变化趋势却与对照组相似，说明低滴度病毒对平台期HEK293没有产生CPE效应（图11B，蓝色和绿色曲线）。

图11. 实时监控VSV病毒感染HEK293细胞的生长状况。（A）对数生长期细胞标准化CI值；（B）平台期细胞标准化CI值。RTCA实时无标记细胞功能分析仪每15min检测一次VSV病毒对HEK293细胞黏附伸展及扩增的影响。

    Vero E6与HEK293唯一的不同之处在于HEK293能产生Ⅰ型干扰素，Vero E6敲除了Ⅰ型干扰素基因，Ⅰ型干扰素基因可以上调抗病毒活性蛋白如MxA及OAS/RNaseL蛋白的表达，这就导致了两种细胞对VSV病毒的不同响应。HEK293细胞有完全的干扰素系统，当病毒感染时，HEK293细胞能产生干扰素并激活JAK/STAT信号通路，并引起抗病毒活性蛋白表达量的增加，细胞的抗病毒能力随之增强。因此，推测本实验中干扰素系统的作用是HEK293细胞对低滴度病毒（PFU 80,000）产生抗体的关键因素。细胞对VSV病毒的不同响应有助于研究细胞的抗病毒作用机制。
    综上所述，与常规终点法相比，RTCA实时细胞分析技术可以实时动态监控病毒与宿主细胞相互作用，且无需标记，为科学研究带来了极大的便利。

应用实例二：RTCA实时定量检测病毒侵染效力及评估中和抗体效价
       
    本研究中，以H1N1病毒为例，着重介绍RTCA实时细胞分析技术在病毒学检测中的应用。我们应用实时细胞分析技术实时监测MDCK细胞中的H1N1病毒引起的细胞病变效应，并进行定量分析。同时，用该法评估了21个接种H1N1流感疫苗的健康个体在接种前和接种后的中和抗体效力，并与传统凝血实验得到的数据进行对比。
    为确定合适的MDCK细胞接种数量，向E-Plate检测板接种不同数量的细胞，利用RTCA技术进行细胞增殖检测。根据细胞增殖曲线，确定1×104/孔为最佳接种量。根据不同剂量TPCK-胰蛋白酶作用下病毒对MDCK细胞的侵染情况，确定最佳的胰蛋白酶浓度为2.5ug/ml，此浓度对MDCK细胞增殖的影响最小。
    MDCK细胞到达对数生长期时，向其中分别加入5.5×108/ml的SH37T的SH143T病毒株，RTCA实时动态监测病毒介导的CPE，同时显微镜下观察细胞CPE状态（图12A）。随着H1N1病毒的大量复制，导致细胞逐渐死亡，RTCA检测显示细胞指数（CI）下降（图12B），而对照组未感染细胞呈正常增殖状态。平行进行的WST-1实验进一步证实了细胞指数（CI）变化可反映H1N1病毒介导的CPE（图12C），在WST-1实验中，细胞感染病毒后，活细胞量减少，引起吸光值明显下降，该结果与RTCA检测获得的结果是完全相同的。上述试验表明RTCA实时细胞分析技术可实时动态和准确的检测H1N1病毒感染引起的CPE。当测试感染病毒数下降一个梯度时，CPE起始时间延迟约8h，说明病毒负荷量与CPE之间有直接的相关性。

图12. RTCA实时动态检测H1N1病毒引起的细胞CPE。（A）显微镜下检测MDCK细胞被SH37T病毒株（1:10稀释）感染24h，48h，72h后的反应情况。（B）RTCA实时动态检测SH37T病毒株感染MDCK细胞引起的效应。箭头指示在该时间点加入不同稀释梯度的病毒。（C）比色法检测SH37T病毒株（1:10稀释）感染MDCK细胞引起的细胞CPE，A450波长处测量病毒感染24h，48h，72h后的OD值。（D）比较两类病毒株SH37T和SH143T在相同数量下的侵染情况，红色标注线代表两类毒株感染细胞引起的细胞指数CI降到0时所需要的时间。

表3. 两类病毒株的TCID50，病毒载量及每TCID50单位的病毒载量。

    另外，在病毒载量相同的情况下，病毒株不同，所引起的细胞CPE起效时间及细胞完全死亡时间也不同。例如，在病毒载量为10-1稀释浓度时，毒株SH37T感染引起的细胞全部死亡发生在37h，而毒株SH143T感染引起的细胞全部死亡发生在48h（图12D）。使用比色法TCID50检测，结果显示每TCID50单位SH37T病毒载量小于SH143T（表3），这与RTCA获得的结果一致。上述结果表明，RTCA检测不仅可以量化H1N1病毒引起的CPE，也可检测不同菌株的感染效力。
    由于RTCA实时细胞分析技术不仅能够对甲型H1N1流感引起的CPE进行准确的量化，也能定量分析血清中和抗体对CPE效应的阻断或延迟作用。本实验中，我们利用实时细胞分析技术对21个血清样本的免疫效价进行了检测。首先，将MDCK细胞接种于E-Plate检测板上，加入经SH37T病毒预处理的血清，血清稀释浓度分别选择为S0 1：40，S1 1：80，S2 1：160，每组设三个复孔，若血清浓度高于此浓度，病毒复制会被完全抑制。每组加入100 TCID50 单位的病毒载量，RTCA实时监测H1N1病毒介导的CPE，结果见图13。经S0血清处理的细胞指数很快下降为0，其作用曲线接近病毒对照组，表明S0血清稀释浓度高于20倍以上时无法抑制病毒复制。而对于S1和S2，直至血清浓度分别稀释到320倍和1280倍时才观察到细胞死亡，细胞增殖曲线接近细胞阴性对照组（图13B,C）。结果显示S1和S2中和抗体滴度分别为160和640。

图13. RTCA实时监测H1N1病毒介导的CPE。

本实验中，对21对H1N1疫苗接种前和接种后的血清样本进行检测，RTCA中和试验（NT）和传统检测方法试验（HI）同时进行。结果显示两种检测方法的抗体滴度结果的数据都呈现出明显的统计学差异（p<0.05，威氏符号秩序检验）。且两种方法结果具有良好的相关性（Spearman相关系数，r=0.78，p<0.01）。另外，在接种后21天抗体对疫苗的免疫应答达到最大反应时计算抗体滴度值。两种检测方法无明显差异（p>0.05）。因此，RTCA实时动态NT实验结果与传统的HI实验结果是一致的，说明利用RTCA实时细胞分析技术可以准确的定量检测抗体滴度。

以上内容为大家展示了RTCA实时细胞分析技术的一部分应用领域。基于该技术无标记、实时监控、对细胞无损伤等技术优势，RTCA实时细胞分析技术无论是在药物开发研究还是基础生命科学领域都具有广泛的应用：
药物研发
● 药物毒理学分析                         
● 抗肿瘤药物筛选和研制                 
● 抗肿瘤药物疗效观察                 
● 现代中药的开发和药理机制分析       
● G-蛋白偶联受体相关疾病药物的筛选和研究
● 环境毒理学
● 抗肿瘤转移药物筛选和研究
● 神经营养药物的筛选和研究
● 基因诊断及药物疗效的基因学分析

基础研究
● 细胞生长、分裂和死亡的机制研究       
● 细胞表面受体配体结合研究                 
● 细胞质量控制                         
● 细胞粘附和细胞伸展                 
● 细胞生长、分化微环境研究
● 细胞生长因子的生物学功能研究
● 基因功能研究
● 受体介导的信号通路

相信艾森生物RTCA实时细胞分析技术和其一系列实时细胞动态分析仪产品的独特优势将会很大程度上解放研究者的劳动力，对细胞生物学研究带来极大的方便，和极大的飞跃。

周尧老师您好，我有以下问题要请教：

这个方法和胞内细胞染色方法有什么区别？ 有什么优点？

原文由 吃柿子的季节(v2803494) 发表:

周尧老师您好，我有以下问题要请教：

这个方法和胞内细胞染色方法有什么区别？ 有什么优点？

艾森的实时细胞分析技术采用特殊工艺，将金微电极阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部，用于构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测系统。该检测原理无需任何染料标记，并且仪器放置在细胞培养箱内，因此细胞是在完全的培养条件下进行测定。该系统可以最低1秒钟测定一次，并可随意设定测定频率，因此可以真正意义上反映出动态细胞的生物动力学变化曲线，不会遗漏重要的实验结果。由于细胞没有经过染色，因此细胞还可以被收集提取蛋白及DNA/RNA进行western及PCR实验，完美实现同一批次细胞多指标研究，大大提高实验的准确性。省去重新培养细胞进行上述实验的繁琐。而传统的细胞染色方法是选取某一特定时期的细胞进行检测，并且不同的细胞染色方法也只能对特定细胞进行检测（如Calcein-AM染色法检测活细胞、台盼蓝染色法检测死细胞、PI染色法主要检测坏死细胞或晚期凋亡细胞等），这些方法无法全程检测细胞的生长和变化过程，这种断点式、特殊细胞群体的检测极大的局限了生物信息的全程动态收集。

你所提到的胞内细胞染色方法是否指的是基于流式细胞术对胞内抗原和细胞因子的检测技术？该法检测的是胞内抗原和细胞因子的表达情况，并不是对细胞状态的检测，与实时细胞分析技术检测的对象是不同的。艾森实时细胞分析技术的优势可参看文中实时细胞分析技术原理的内容。

原文由 吃柿子的季节(v2803494) 发表:

周尧老师您好，我有以下问题要请教：

这个方法和胞内细胞染色方法有什么区别？ 有什么优点？

1.RTCA不需要染色，所以避免了染色对细胞生长的影响。

2.实时细胞分析没有盲点，每秒记录一次，得到的曲线更准确。

3.作癌细胞分析时可以看到浸润迁移的过程。

4.作心肌细胞培养时可以看到心肌细胞的跳动。

http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20130504/4712032/    资料