主题：【原创】单糖、多糖、聚合糖HPLC检测方法及实验数据理论

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发表于：2015/01/23 15:40:57 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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单糖、多糖、聚合糖HPLC检测方法及实验数据理论

目简述

糖的分析在许多行业有着重要意义。现有许多不同的分析技术用于糖的分离和测定，它们包括化学分析、比色分析、纸色谱、薄层色谱、和高效液相色谱(HPLC) 等。
考虑用HPLC测定糖的定性和定量分析具有快速、灵敏、样品处理简单等优点。从大量的文献报道和综述中可以看出，由于糖的特殊结构及它本身不含强紫外和荧光吸收的官能团，到目前为止还没有建立一个统一的HPLC方法来分析所有的单糖和低聚糖。对各种分离系统也不易比较，许多分离参数（洗脱形式、分析时间、复杂化台物分离情况和柱效率、柱稳定性和柱使用寿命）制约着糖的HPLC分离技术。目前有不同类型的柱子和检测器用于糖的分离和检测。
一、分析糖色谱柱概述
1.1 化学健合烷基柱

在C18柱上用水作流动相对不衍生单、双、叁糖进行分组分离，糖的保留时间较短且分离效果不好。由于所有单糖结构相近很难分离，所以C18柱不适合于较复杂糖混台物的分析。
为解决单糖类的分离采用衍生法可改变糖的局部结构，在C18柱上基本分开。其方法有：糖先进行还原胺化再用异硫氰酸苯酯试剂进行衍生, 用l-苯-3甲基5-吡唑啉酮试剂衍生,等等衍生方法。

1.2 阴，阳离子交换树脂
阴离子交换柱以NaOH水溶液为流动相，糖在阴离子交换树脂上洗脱顺序为多元醇、单糖和低聚糖，但改变流动相组成或改变柱温可以改变保留顺序。
阳离子交换柱阳离子交换树脂柱以4％～l0％交联磺化的聚苯乙烯一二乙烯基苯(PS/ DVB)共聚物为基质，树脂通常吸附Ca，Pb，Ag，Na ，H, 等金属离子为金属抗衡离子，以蒸馏水作流动相，在80-90℃温度下来分离糖。
月旭科技目前以Xtimate^®Sugar-Ca 型阳离子交换树脂柱，Xtimate^® Sugar-H型阳离子交换树脂柱使用较广。
钙型阳离子交换树脂柱，以纯水水溶液为流动相可分离蔗糖，果糖，葡萄糖，等或以含EDTA.Ca水溶液作流动相可分离单糖、双糖。
氢型阳离子交换树脂柱应用也很多，以0.04 mol/L H₃PO₄水溶液或pH为2.5硫酸水溶液为流动相可分离乳糖、葡萄糖和果糖等，以H₃PO₄水溶液为流动相分离一些糖和有机酸。
1.3 氨基健合硅胶柱
氨基健合硅胶柱通常在室温下用乙腈一水作流动相，分离常见的单糖和低聚糖，糖出峰顺序为单糖、双糖和较高低聚糖，随着流动相中水含量的增加糖的保留时间减少，并且氨基柱柱子有较短的使用寿命，这是柱填料自身水解以及还原糖与氨基之间形成希夫碱,造成柱寿命降低。
二、检测器概述
用HPLC测糖，选择合适的检测器是很重要的，用于HPLC的检测器很多，根据样品中的糖的种类、含量和纯度来选择合适的检测器
2.11 示差折光(RI)检测器
RI检测器是HPLC测糖最常用的检测器，它具有稳定、易于操作，样品不被破坏和具有较好的灵敏度等优点。
虽然RI检测器应用很广，但也存在一些缺点，它受温度和流动相组成的影响，不能使用梯度淋洗；对于糖含量较低的样品，RI检测器的灵敏度达不到要求。
2.12 UV—VWD紫外检测器
UV—VIS检测器在HPLC测糖中起着重要作用，它不需严格的温度控制，糖只在近紫外区190nm附近有吸收，UV检测器可用于未衍生糖的检测，但在此波长区，流动相和样品中不能含有吸收的杂质，必须用超纯的流动相和较纯的样品，它的检测灵敏度与RI检测器相差不大。若采用衍生试剂与糖进行柱前或柱后衍生反应，生成具有强紫外或可见吸收的物质，可大大提高检测灵敏度。
三、实验方案（化学健合相色谱柱）

多糖衍生紫外检测器测定法。

测定目标物质：

混标：甘露糖，盐酸氨基葡萄糖，鼠李糖，葡萄糖，木糖，半乳糖，阿拉伯糖，岩藻糖

检测波长：	254nm
柱温：	30℃
流速：	1ml/min
进样量：	20μl

流动相配制：
流动相A:乙腈。
流动相B：50Mmol磷酸二氢钾缓冲液（精密称取磷酸二氢钾6.804g置于量瓶中加水溶解至1000ml，混匀后，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.9）
梯度程序：

时间（min）	流动相A(%)	流动相B(%)
0	17	83
5	17	83
25	18	82
30	17	83

�

11种糖衍生方法测定

检测波长：	254nm
柱温：	25℃
流速：	1ml/min
进样量：	20μl

流动相配置：

流动相A：50Mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐ph值7.0（称取磷酸二氢钾6.804g置于烧杯中加入水溶解定容至1000ml，用30Mmol/L氢氧化钠溶液调节ph值至7.0），均用0.45μm滤膜过滤。

流动相B：乙腈

梯度程序：

时间（min）	流动相A(%)	流动相B（%）
0	83	17
15	78	22
30	83	17

月旭Ultimate^®XB-C18（4.6*250mm，5μm）

四、实验方案（阳离子交换树脂，月旭Xtimate^®Sugar-Ca,Sugar-H）

单糖测定样品数据(示差检测器)

月旭Xtimate®Sugar-Ca（7.8*300mm，8μm）

流动相：	纯水
检测器：	示差折光检测器
柱温：	柱温：75℃，检测器温度：40℃
流速：	0.2ml/min
进样量：	10μl

样品制备：

供试品:分别取磷酸果糖二钠、蔗糖、葡萄糖、果糖各50mg置于10ml 的量瓶中加水溶解稀释至刻度。

单糖测定样品数据(紫外检测器)

色谱条件

色谱柱：	月旭Xtimate®Sugar-H（7.8*300mm，8μm）
流动相：	0.04M磷酸水溶液
检测器：	紫外：200nm
柱温：	柱温：50℃
流速：	0.5ml/min
进样量：	20μl

样品制备：

样品溶液：混合溶液。称取葡萄糖250mg、果糖250mg，加水溶解定容到10mL。精密量取1mL，用流动相稀释到10mL。

五、实验方案（氨基健合硅胶柱，聚丙酰胺健合硅胶柱）
蜂蜜中的多糖测定（氨基健合硅胶柱）
色谱条件：

色谱柱：	月旭Ultimate®XB-NH₂（4.6*250mm 5μm）
流动相：	乙腈/水= 75/25（混合配制）
检测波长：	示差检测器（RID）
柱温：	柱温：40℃，检测器温度40℃
流速：	1ml/min
进样量：	15μl

样品制备

对照品溶液制备：精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖适量，加入40%乙腈溶解，使其各浓度分别为果糖10mg/ml，葡萄糖8mg/ml，蔗糖0.5mg/ml，麦芽糖0.5mg/ml；

低聚果糖测定（聚丙酰胺健合硅胶柱）
色谱条件：

色谱柱：	月旭Ultimate®Amide （4.6*250mm，10μm）
流动相：	乙腈-水=70：30
检测波长：	示差检测器
柱温：	40℃
流速：	1ml/min
进样量：	20μl

六、项目总结

综述以上三大项不同键合相不同方法分别采用了，C18键合相，阳离子聚合物基质，氨基硅胶健合以及聚丙酰胺健合硅胶柱，做单糖，多糖，聚合糖测定时需要考虑以下几点

1、简单混合糖物质分离可用C18烷基键合柱衍生解决，并且可以采用梯度洗脱方式采用紫外光谱测定，检测效果稳定，重现性好，所需时间短并所用流动相简单。

2、对于较复杂化合物的分离，可采用氨基键合柱和阳离子交换柱的较多，使用方便，不需要衍生操作，色谱条件简单，能解决许多分离问题，但也存在稳定性问题，氨基柱易水解重现性稍微差一些，示差折光检测的灵敏度低于紫外检测器哦，可分离常见的几种果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，等单糖及聚合糖。

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