主题：【讨论】看图解读畅谈之六：正反相液相色谱分析法——实例列举经验畅谈

反相高效液相色谱缓冲体系PH的选定（资料分享）



反相高效液相色谱中缓冲体系PH值的选择在反相高效液相色谱分析中，选择正确的缓冲液PH值，对可离解的化合物分析的重现性十分重要，不恰当的PH值可能导致不对称峰，宽峰，分裂峰或肩峰，而尖锐的，对称的峰是定量分析中获得低的检测限以，两次分析之间较低的相对标准偏差（RSD）和保留时间的高重现性的前提。我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的PH值，以及如何选择正确的缓冲体系。

什么时候需要缓冲溶液？
在反相液相色谱分析中，流动相的PH值一般在2.5－7之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的PH值在2.5－7之外时，就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在1－11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。

如何选择缓冲液PH值
在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH＝Pka＋log（/）得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。

让我们通过一个例子来看如何选择PH值
例如苯甲酸图（一）        C₆H₅ -COOH = C₆H₅ -COO^-  + H⁺
图（一）
显示的是它的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上由PH公式得知，当溶液PH值等于2.2时，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围。从表1知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能用于PH值等于2.2。
表1
Phosphate  磷酸Pka1=2.1  PH=1.1－3.1
Pka2=7.2  PH= 6.2－8.2
              Pka3 =12.3  PH=11.3－13.3
Citrate  柠檬酸 Pka1=3.1  PH=2.1－4.1
              Pka2= 4.7  PH=3.7－5.7
              Pka3=5.4  PH=4.4－6.4
Formate 甲酸  pka=3.8  PH=2.8－4.8
Acetate  醋酸  pka=4.8 PH=3.8－5.8
Tris（hydroxymethyl）aminomethane  三(羟甲基)氨基甲烷  pka=8.3 PH=7.3-9.3
ammonia  氨  pka=9.2 PH=8.2-10.2
borate  硼酸  pka=9.2 PH=8.2-10.2
diethylamine  二乙酸  pka=10.5  PH=9.5-11.5
当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的PH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1 可值，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。
在上面两个例子中，PH＝3的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。

为离子对试剂选择缓冲液
为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的，离子对试剂例如四丁基铵的盐，十四烷基磺酸钠等，在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对，在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。

应用缓冲液PH值来调节方法选择性
如前面提到的，氨基化合物的保留随PH的减小而降低，这个特性可以用来调节方法的选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，适当改变PH值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠PH值，所以变化PH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果PH值变小，出峰便快，则化合物中可能存在氨基，当PH变大,化合物出峰很快，或流出在死时间处，化合物可能是一种羧酸，因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。

总结
正确选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰，捡出限，以及获得稳定的保留时间十分重要，如果你知道化合物官能团信息和化合物的Pka值这一过程将十分简单。
   
 

我基本都是用正相，反相没有用过

原文由 老多_小多(emoc98311) 发表:
我基本都是用正相，反相没有用过

正相色谱分析检测范围较小，老多老师您能分享一下您所检测的化合物，使用的检测器  色谱柱 以及检测条件 吗？谢谢！

我和老多老师相反，反相用的多一些，正相用的很少。

原文由 夏天的雪(bingwang228) 发表:
我和老多老师相反，反相用的多一些，正相用的很少。

嗯，我也是反相用的多一些，希望能够通过讨论交流学其之长补己之短，共同进步。

原文由 老多_小多(emoc98311) 发表:
我基本都是用正相，反相没有用过

做什么样品呀？我正好相反大多为反向的C18柱

原文由 一片枫叶(v2960432) 发表:
嗯，我也是反相用的多一些，希望能够通过讨论交流学其之长补己之短，共同进步。

相互学习吧

总的来说应该是反相用得多,正相一般用在极性很强的化合物分离.

反相有什么柱子？多用于什么项目检测？

原文由 上党之巅(wodedipan) 发表:
做什么样品呀？我正好相反大多为反向的C18柱

差不多，反相用的多，C18用的多