关黄柏是一种药材，属于芸香科植物黄檗的干燥树皮，去除外表粗皮，晒干既得。一般为黄色，黄绿色，棕黄色等。味极苦，具有清热去火、除湿止泻、解毒止痛等多种药物功效，可治疗和预防多种疾病，是中药材中比较便宜而实用的一种。
现在药典对中药材都有严格的检测项目，关黄柏也不例外。下面我们具体介绍下关黄柏高效液相色谱检测方法及效果。
实验部分
1.原理
取关黄柏适量，粉碎过药典筛三号筛，60%乙醇溶解提取，注入高效液相色谱系统，经C18色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法（保留时间定性、峰面积定量）计算出结果。
2.仪器及试剂
仪器：高效液相色谱仪（紫外检测器+梯度泵+柱温箱+在线脱气机等），超声波清洗仪，溶剂过滤器，电子天平，药典筛（三号筛）等。
试剂：乙腈（色谱纯），磷酸二氢钠（分析纯），磷酸（分析纯），乙醇（分析纯），超纯水，盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品等。
3.样品制备
对照品溶液制备：分别准确称取盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品各2.5mg于50ml容量瓶中，加60％乙醇适量，使对照品完全溶解，再加60％乙醇至刻度，摇匀，配制成各含50μg/ml的混合对照品溶液，备用。
供试品溶液制备：取关黄柏适量，充分粉碎后过药典筛三号筛，精密称取过筛粉末0.2g于50ml容量瓶中，加入60％乙醇30-40ml，超声处理1小时，放冷，加60％乙醇至刻度，摇匀，0.45um有机相微膜滤过，滤液待测。
4.色谱条件
检测器：紫外检测器
检测波长：345nm
色谱柱：Promosil C18 ( 250 mm × 4.6 mm，5μm )
流动相：A（乙腈）：B（0.02mol/L磷酸二氢钠溶液）=25：75（V：V）
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：10μl
5.色谱图
对照品色谱图：

供试品色谱图：

供试品局部放大色谱图：

上面这种流动相方式，供试品色谱图被测物峰后面杂质没被洗脱出来，这样进几针样品后色谱柱柱容量就会下降，很有可能会影响到后面的检测。
6.流动相改为：A（乙腈）：B（0.02mol/L磷酸二氢钠溶液）=30：70（V：V），其它条件不变，效果如下。
色谱图
对照品色谱图：

供试品色谱图：

供试品局部放大色谱图：

上面这种流动相方式，色谱图中被测物保留时间缩短了，但分离度也差了，也可能有一些杂质没被洗脱出来，检测结果的准确性可能会受到一定程度影响。
7.下面采用梯度洗脱方式，其它条件不变，梯度表：

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
1	0	25	75
2	20	25	75
3	40	65	35
4	41	90	10
	50	90	10
5	51	25	75
6	65	25	75

色谱图
对照品色谱图：

供试品色谱图：

供试品局部放大色谱图：

这种流动相方式效果就很好，既达到保留时间短的效果，又保证了分离度，检测结果准确、可靠，连续进样也不会受到影响。
8.色谱柱长由250mm变为150mm，流动相仍采用：A（乙腈）：B（0.02mol/L磷酸二氢钠溶液）=25：75（V：V），其它条件不变，效果如下。
色谱图
对照品色谱图：

供试品色谱图：

这种方式，被测物的保留时间更短了，但分离度也更差了，色谱柱理论塔板数也明显低了，这种方式不适合该样品检测。
看来流动相和色谱柱对检测效果影响很大，主要体现在保留时间、分离度和色谱柱理论塔板数上。
9.总结
1）对于反相色谱来说流动相中有机相比例越高被测物保留时间越短，分离度越差，色谱柱理论塔板数越低，反之相反。
2）流动相中有机相比例低到一定程度，样品中某些成分可能洗脱不出来，一是可能影响检测结果，二是可能影响柱效，连续进样影响后面检测。
3）同样规格长度越短的色谱柱被测物保留时间越短，分离度越差，色谱柱理论塔板数越低，反之相反。
4）对于复杂样品（一般都是分离度不好），梯度洗脱方式是最好的选择。这种方式有很多优点，最主要的就是缩短保留时间，增强分离度，检测结果准确、可靠。
5）色谱柱和流动相可以有很多种调节方式，一般都得理论结合实践，切不可盲目行事。

6)色谱分离是色谱分析的核心部分，流动相和色谱柱是影响色谱分离最主要因素，是色谱条件的重要组成部分，往往也是改变分析效果的决定因素。检测时根据实验要求尽可能选择最理想的色谱柱和最佳的流动相方式。

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