实验室准备开展《检测血浆中游离型MNs来诊断嗜铬细胞瘤》的项目，这个项目以前我们从来没有做过，方法、仪器都是零基础。领导的意思是先把方法弄通了，再落实各项仪器。实验中需要的好几项重要仪器，如高速离心机、全自动固相萃取、电化学检测器等等，我们都还没有。在条件欠缺的情况下，只能是自行进行变通了，没有条件就创造条件。
先介绍一下，什么是游离型甲氧基肾上腺素类物质（MNs）？
游离型甲氧基肾上腺素类物质(MNs)包括甲氧基去甲肾上腺素(Normetanephrine, NMN)和甲氧基肾上腺素(Metanephrine,MN)。它们主要来源肿瘤细胞，与儿茶酚胺长期分泌增加有关，不受肾上腺交感神经兴奋影响，半衰期相对较长，不易产生波动，能够准确的反应嗜铬细胞瘤儿茶酚胺合成的真实情况。临床上检测游离MNs已经是诊断嗜铬细胞瘤的重要指标了。

这是检测MNs的参考方法。第一次看到这个方法的感觉就是这个方法里要配好多溶液呀，大概得有9种左右。不过，这还都是小事，配好就是了。比较麻烦的还是方法里好些设备我们还不具有，包括肝素管、离心机、快速冻干机和电化学检测器。这几项我只能是用现有条件来替代了，我用水替代血浆，这样也不用离心机了，用真空氮吹浓缩仪（LabTech）替代快速冻干机，并且用紫外检测器来替代电化学检测器。但这些替换是否可行，还是需要进行验证，所以结合实验方法，我设计了一个实验思路。

有了明确的思路，接下来工作开展起来就比较容易了。

1、检测问题
用UV检测的话，选择波长值是第一问题。实验室刚好有紫外分光光度计，利用光谱扫描功能，对MNs进行190nm~1100nm的光谱扫描，发现这两种MNs吸收光谱相似，且都在225nm处有最大吸收，所以HPLC-UV方法中选定225nm为测试波长。
按照方法给的液相条件，进行进样。测试检出限为 10ng/mL，这个值离电化学检测器的0.1ng/mL 足足相距100倍呀！不过好比没有信号强，至少确定HPLC-UV检测MNs还是可行的。

2、浓缩问题
用快速冻干机是因为SPE洗脱液中含有一定量的水，而且MNs在空气环境下容易变质，需要有氮气或真空保护。真空、氮气！这不正是我们实验室的LabTech Vortex600全自动浓缩仪嘛，它即抽真空，有通氮气，而且整个浓缩杯内环境是密闭的，可以给标样营造一个很好的纯氮气环境，起到保护标样的作用。
果然，由Vortex浓缩后，标样的回收率在90.93%~97.36%，损失很小，而且干燥时间（1h）也比冷冻干燥（2h）快了一倍，节约了不少时间成本。由此看来，用LabTech Vortex600进行浓缩干燥是可行的，可以说是很好的。

图浓缩前后标样的色谱对比图

3、SPE方法
浓缩问题也解决了，终于可以开始实验的核心部分了——确定SPE方法及自动固相萃取系统验证。
先用手动固相萃取来摸索方法。按照参考方法里的SPE过程，做了三次平行，回收率都低得可怜，只有50%~70%！
为了提高回收率，我又仔细分析了一下整个萃取过程：SPE用的柱子是强阳离子交换柱SCX，这种柱子主要是吸附弱或强的正电离子。MNs的结构中有一个仲氨基，属于弱阳离子，pH越小，越有利于仲氨基带正电。实验中样品的pH 是7.0，是中性的，如果降低样品的pH值的话，应该可以增强MNs的正电强度，越有利于萃取柱对它的吸附。
于是，我在样品中加入400μL 的0.2M醋酸，降低样品的pH值。果然，经过pH改性后的样品进行SPE后，回收率增大了，84%~95%！
4、方法转移至全自动固相萃取系统
实验室有一台自动固相萃取系统试用机是LabTech Spline，这台仪器是4通道并行，128位的，位数多能满足我们大量的样品。
因为一般自动固相萃取系统内部都会有一定的管路，存在死体积，所以我编辑方法时把所有SPE步骤所用到的溶剂体积都增大了1~2mL，以保证整个实验的回收率。