主题：【第十届原创】一次失败的方法开发教训及其今后的开发思路

从业20多年来，开发过完整的分析方法不下数十个，虽然不见得都做的很好，有创新，但还没真遇到失败过，但现在我真在一个方法开发上由于回收率根本无法达到要求，而失败。 这个罕见的实例深深的教育了我！
前些日子，受一家药企的要求，开发一种药物中痕量残留碘离子的检测，一开始就希望用离子色谱法来测。这是一种含有贵金属的一种有机物，在水中微溶。碘用离子色谱是能检测的，但是对于这个含贵金属的有机物，如果在水中不溶或难溶，就存在回收率的问题，如果全溶，直接进样对色谱柱可能存在极大的伤害，尤其后面接了抑制器。
因此我一开始，就考虑用HPLC直接分析碘离子，因为碘在紫外有响应，而且优于电导，如果HPLC能做，则成本低，速度快，查阅文献用HPLC则并没有报道，但凭我的直觉，HPLC应该是可以的。而且这药物本身含量是用HPLC分析，直接溶解后进样，没有前处理，回收率就不会有问题，操作会比较简单。
碘其本身是一个体积大的离子，有极性，在C18柱中肯定是有保留的，事实也证明如此，为了延长碘的保留，在流动相中添加了TBA，实验效果也证明添加TBA可延长碘的保留时间。这样，可以通过添加有机物来控制碘和药物保留时间。
对样品分析，并没有检测到碘的存在，进样重复性也没有问题，初步检测方法的灵敏度可达到0.2mg/L，能满足药物申报的要求。于是按照要求进行方法学验证，由于主要是学生在做，等做完检查才发现有问题，线性存在一种奇怪的现象，浓度越低，响应越小，而且在低浓度下，碘的峰型变形（见图1），重复做了几次才勉强可以。更吃惊的是后面，添加微量的碘后，根本检测不到，等到检测到碘，回收率远远偏低，保留时间似乎发生了偏移，出现鬼峰。这结果难以置信，于是我与学生再次重复试验，亲自坐镇，当添加已知的碘离子，出来的峰保留时间飘移，峰面积变小，出现额外的峰时（见图2），我才明白，这近一个月的工作几乎白费了，也明白药厂一开始就提醒我注意回收率。
[img=,602,362][/img]
图1 1 0.1ppm，2 0.2ppm，3 1ppm
[img=,602,362][/img]
图2 上加碘标样， 下 样品
浪费了大量的时间，怎么办，重新回到离子色谱法，采用标准的阴离子分析，NaOH体系，样品的溶解性也不管了，柱子寿命也不管了，在抑制器后同时接电导和紫外检测，由于样品全溶解，溶解度为0.5%，原来以为药物不出峰，结果样品会被洗脱，主峰在4.5分钟，样品中测到了痕量的碘在7.9min（与液相结果不同，图3电导，图4紫外）但是拖尾至少有10分钟，因此这种严重拖尾的情况根本无法用于实际样品的分析。怎么办，换检测器，于是用安培检测器代替紫外检测器，更换了柱子，在安培上药物本身没有响应，非常好，因此对碘就没有干扰，但是碘却出现拖尾（图5安培，图6标样碘），还是不行，怎么办，只有一个星期时间，加上我要出差，要优化完成方法开发和验证，已经不肯能了，暂时也没时间进一步研究，只能放弃。这是我有史以来，面对一个似乎并不难的课题，第一次败下阵了，其教训是非常深刻了。
[img=,692,389][/img]
图3 电导检测的结果
[img=,692,389][/img]
图4  紫外检测的结果
[img=,692,389][/img]
图5 安培检测的结果
[img=,692,389][/img]
图6 碘标样的安培检测
这些天我一直思考这个问题，探究这个样品的特性，为以后进一步的探究提供思路：
1 任何分析方法，尤其痕量分析，回收率是第一关，回收率做不到，这个方法就无效，虽然我在有样品前处理的方法中首先做回收率，但是在没有任何前处理，就忽视了这一点，这教训告诉我，不管是否样品前处理，回收率优先做，同时考察线性。
2 离子色谱能测到碘，而液相不行，这实际上明确告诉我，液相色谱方法测碘有问题，这些碘哪里去了？如何解释？思考了半个月，才豁然开朗，我明白是使用离子对试剂的缘故，TBA作为离子对试剂，是否强行保留了一些碘离子，这种现象并没有报道过。另外，当添加碘离子到样品中，微量的碘色谱图看不到(单独进碘能看到），碘多时，却发现有鬼峰出现，多出来一个峰，这似乎告诉我，碘能与样品形成某种化合物，这种现象的存在，使得碘的回收率根本无法做好，尤其当样品会与碘反应。放弃这个方法是必然的，这种奇特的现象只有在实验过程中才会被发现和确认。
3 液相是否就不能分析碘，由于时间关系，我并没有探究其他方法。但我还是相信，选择好分析体系，有可能能避免上面的特例的发生。首先放弃离子对试剂作为流动相添加剂，以无机缓冲液与有机相组合，C18柱碘有足够的保留时间。其次，采用有机酸柱，样品会不会拖尾，拖尾的可能性还是存在的，添加有机改性剂，抑制拖尾或许能解决碘的回收率问题。
4 碘的特点在离子色谱中可以用电导，紫外和安培检测。直接用阴离子柱分离，由于样品存在严重的拖尾，简单的方法是行不通的。采用二维模式，一维针对性的富集，二维再次做，由于切除了大部分的样品基体，方法上肯定可以，但是二维的方式并不是最佳的方式。
5 在淋洗液中添加甲醇或乙腈，理论上样品的拖尾会被抑制，如果只需要加少量的有机相（10-20%），能使样品与碘基线分离，用紫外检测则可以分析碘。
6 选择合适的柱子，用安培检测器检测碘，在前面已经证明，在安培模式下，样品对碘的测定没有干扰，前面没结果是没有更多的优化，理论上选择合适的柱子和流动相，对方法优化，分析痕量碘是可行的，也应该是最佳的分析方法。
虽然厂家已经没有要求我们做了，但是不管多少代价，我必须弄清楚原因，也许后面会有一篇，最后用离子色谱的解决方案。