主题：【第十届原创】2017饮料中着色剂草根比对实验记录

2017饮料中着色剂草根比对实验记录

      2017.7.3收样，开箱后，样品一份，居然配了聚酰胺固相萃取柱，窃喜，前处理可以不用聚酰胺粉折腾，方便许多。

实验准备

试剂与耗材
    固萃用：
          20%柠檬酸溶液，实测PH=1.38
          甲醇－甲酸液（体积比6+4），乙醇-氨水-水（体积比7+2+1），
        PH=4水：100ml纯水加2滴20%的柠檬酸液，实测PH=3.30
        PH=6水：直接用纯水，实测PH=6.02
        聚酰胺小柱：由北京振翔科技提供，BESEP  POLYAMIDE 500mg/6ml
      流动相：
          甲醇：Amethyst  Chemicals    HPLC/ACS
        乙酸铵溶液：0.02mol/L，0.45μm滤膜抽滤后使用
      标准品
        中国计量科学研究院购买食用合成色素柠檬黄溶液标准物质（编号GBW(E)100001a），浓度为0.500 mg/mL，食用合成色素日落黄溶液标准物质（编号          GBW(E)100003a），浓度为0.500mg/mL
      标系配制
          1.预实验配制20ug/mL的标准点进样，取样品过0.45μm滤头直接进样，粗略估计样品中目标组分含量范围，确定标准曲线的范围
          2.取10mL比色管4个，分别加入柠檬黄标准溶液0.2,0.4, 0.8, 1.2mL。加入日落黄标准液0.4， 0.8， 1.2， 1.6mL。纯水定容至10mL，得到柠檬黄日落黄的混合标准系              列溶液，混匀备用，含量如下：
            柠檬黄（μg/mL）    10    20    40    60
            日落黄（μg/mL）    20    40    60    80
仪器与设备
      戴安液相色谱（P680 HPLC）  UVD170U紫外检测器(吸收波长254nm )
      色谱柱：安捷伦柱  5μm  4.6*250mm
样品前处理
    1.样品瓶盖旋松，超声30min除气
    2.取10mL样品到小烧杯中，测得PH值为3.80，不再考虑调PH
    3.刻度吸管取样5mL到10mL比色管中，纯水稀释定容至10mL备用，两份用于直接进样，两份用于固萃净化后进样。并制备加标样品。
固萃的过程
    因为实验室全自动固相萃取仪最大只支持3ml固萃柱，本次提供的固萃柱是6ml的，因此只能土法上马，如图

固萃（由于没有采用真空泵抽滤，故耗时较长，整个过程近3小时）
    1.活化 6mL甲醇    时间15-17min
    2.平衡 6mL PH=6水  时间25-30min
    3.上样  5mL        时间15-20min
    4.酸洗 PH=4的水  3mL+3mL 时间15-20min
    5.淋洗：先6ml 甲醇-甲酸溶液（体积比6+4）  后 6ml 水PH＝6，采用2+2+2，洗至中性        时间25-30min
    6.洗脱：6ml 乙醇－氨水－水（体积比7+2+1） 采用3+3，10ml比色管收集

氮吹
洗脱液置氮吹，水浴65℃ 氮吹45min，剩余1-2mL，纯水定容至10mL

液相色谱分析
进样20μL,
梯度洗脱程序：

时间（min）	流速 （mL/min ）	0.02mol/L乙酸铵溶液（% ）	甲醇（% ）
0	1.0	95	5
3	1.0	65	35
7	1.0	0	100
10	1.0	0	100
10.1	1.0	95	5
21	1.0	95	5

结果
1标准曲线


2样品分析    可以发现固萃后进样，谱图中少了几个杂峰，同时柠檬黄的峰高也降低不少
直接进样

固萃后进样

柠檬黄

	直接进样		直接进样   （加标20ug/ml）		固萃进样		固萃进样   (加标20ug/ml)
峰面积	43.49	43.63	65.26	65.31	19.96	19.28	39.12	39.30
浓度(ug/mL)	39.45	39.57	59.18	59.23	18.12	17.50	35.48	35.65
均值(ug/mL)	39.51		59.20		17.81		35.56
回收率（%）	98.4				88.8

日落黄

	直接进样		直接进样              (加标20ug/ml)		固萃进样		固萃进样 (加标20ug/ml)
峰面积	31.70	31.87	43.90	43.91	29.91	29.58	42.42	41.59
浓度(ug/mL)	49.78	50.04	68.68	68.69	47.00	46.49	65.83	65.09
均值(ug/mL)	49.91		68.68		46.74		65.46
回收率%	93.8				93.6

注：上述数据未经折算，是液相直测，没算折算成10ml定容体积，5.11g取样量时对应结果
结果分析
1.从谱图看出，直接进样与固萃进样两者基线都比较平稳，直接进样杂质峰比较多，而固萃进样去除了杂质峰，从响应值来说，直接进样和固萃进样在待测组分日落黄的响应值相差不大，回收率上也相差不大，但对于柠檬黄检测，固萃进样的响应值明显比直接进样的要小很多，可能经过固相萃取滤去了一些类似柠檬黄的同样有紫外吸收的物质的干扰。
2.柠檬黄直接进样的检测结果比固萃后进样高很多，除了过程损失，可能存在一定干扰组分？
3.本次试验，直接进样，加标回收分别是98.4%和93.8%，固萃后回收率分别是88.8%和93.6%，明显固萃后的柠檬黄回收率低一些，固萃流程可能存在一定问题，希望得到同行的指导
4.由于直接进样和固萃后进样，柠檬黄的结果相差较大，最终上报了固萃进样的结果，最终情况如何等反馈后总结