固相萃取（SoildPhase Extraction，简称SPE）是色谱分析过程中常见的样品前处理方法，主要用于样品净化、待测组分的富集以及溶剂的转换，其原理与液相色谱中的色谱分离相似。固相萃取操作过程中经常会遇到筛板堵塞、流速缓慢、净化效果不理想、重现性差以及回收率不理想等问题，本文拟针对上述问题进行简单分析，并例举一些实验过程中遇到的案例，提供发现问题和解决问题的方法，与各位老师一起探讨学习。
1、筛板堵塞
常见的固相萃取柱通常由柱管、筛板和填料3部分组成，其中筛板是一种具有多孔结构的材料，起到固定填料和过滤溶液的作用。当上样液中含有较多颗粒杂质时，这些颗粒杂质会在筛板上不断聚集，在筛板上端形成一层颗粒层，随着压力的增加以及时间的延长，颗粒层会越来越严实，最终导致筛板完全堵死，溶液无法通过固相萃取柱。遇到这种情况，可以在上样前先高速离心或者过滤，然后取上清液或者滤液过固相萃取柱，减少颗粒杂质的影响。例如食品中人工合成着色剂的测定，当样品为饮料、配制酒等液体时，过聚酰胺固相萃取柱或者G3垂融漏斗还是很轻松的，而当样品为糕点、谷物制品以及果冻时，上样前需先高速离心或者过滤，否则就很容易出现筛板堵塞的现象。
2、流速缓慢
固相萃取过程中流速不能太快，流速太快不利于目标化合物在填料上的保留以及溶剂与目标化合物或者填料的相互作用，从而影响保留或者洗脱过程。当然流速也不能太慢，否则会大大延长前处理的时间。固相萃取过程中导致流速缓慢的原因有：（1）样品粘度高，例如食品中遇到浓缩汁、糖果时，需要对样品充分稀释，降低上样液的浓度；（2）填料较多或者太紧密，此时需要增强负压或者减少填料的使用量；（3）溶剂极性不匹配，例如SN/T1924-2011中淋洗固相萃取柱时，先用水、甲醇，接着用正己烷淋洗，正己烷与前两者的极性不同，从而导致流速很慢，遇到这种情况，可以增加负压或者选用合适的溶剂进行过渡。
3、净化效果不理想
通常固相萃取柱有两种净化模式，一种是采用保留目标化合物的模式，另一种是采用保留杂质的模式，不管采用哪种模式都需要选择合适的填料，使得目标化合物或者杂质能吸附在填料中，同时不需要保留的组分尽可能多的随着溶剂一同流出固相萃取柱。在保留化合物模式下净化样品时，通常会经历上样、淋洗和洗脱三个步骤。淋洗和洗脱溶剂选择的不合适也会使得净化效果不理想。例如淋洗液洗脱强度太弱，淋洗时不能将杂质淋洗掉，或者洗脱液的强度太强，洗脱时将杂质一并洗脱下来，这两种情况均会导致净化效果不理想。由此可见，采用固相萃取柱净化样品时，填料、淋洗液和洗脱液的选择尤为重要。当遇到一些复杂样品，一种填料不能满足净化效果时，可以选择串联固相萃取柱或者采用混合填料的方式进行操作。
4、重现性差
固相萃取中重现性差通常与产品质量、流速以及操作有关。固相萃取柱中填料的质量、均匀性和松紧度都可能影响到方法的重现性，因此选择质量可靠的厂家很重要，遇到重现性差的实验，可以选择用标准溶液考察一下固相萃取柱的重现性。固相萃取过程中流速的快慢也是影响重现性的重要因素之一，上样、淋洗、洗脱过程中适当降低流速，通常而言，流速低于5mL/min时结果较为稳定，有些实验可能需要更慢的流速。当然，操作者水平的高低也会影响到结果的重现性。例如，通常上样前需要活化固相萃取柱，上样过程中不能让填料干涸，浓缩过程不能有损失，复溶的时候需要充分溶解等等，这些都与操作技能息息相关。
5、回收率不理想
在实验中，操作者关注较多的可能也是关于加标回收率的问题，固相萃取柱质量的优劣、固相萃取方法是否合适、操作者操作技能的高低都可以通过加标回收实验进行验证。原则上加标回收率应在80%~120%之间，当然对于多组分目标物同时检测时，这一指标可适当放宽。
回收率的问题通常体现在以下3个方面：（1）目标物没有回收；（2）目标物的回收率较低；（3）目标物的回收率过高。遇到上述情况时，需要对固相萃取过程进行排查，找到问题后对症下药，对实验方法就行修正。如何才能找到问题，其实不难。在一次完整的固相萃取过程中，目标化合物只可能存在于样品的流出液、淋洗液、洗脱液和填料中，我们只需要对这3种液体逐个测定，便能发现问题。
下面例举一些实验中遇到的案例。
案例一、洗脱液对回收率的影响- SCX固相萃取柱净化测定克伦特罗
实验方法：依次用5mL甲醇、5mL水和5mL 0.03mol/L盐酸溶液活化固相萃取柱，将加标的蜂蜜样品提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用5mL氨水-甲醇溶液（体积比5：95）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。
说明：在建立固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗残留量方法时，采用SCX固相萃取柱对加标的蜂蜜样品进行净化并测定，发现回收率为零。
发现问题：采用高浓度的标准工作溶液稀释后直接上样过SCX固相萃取柱，按照上述方法进行净化，分别收集过柱液、淋洗液和洗脱液，并分别对上述3种液体进行测试。过柱液和淋洗液不浓缩，直接上样测定，洗脱液中由于含有氨水，浓缩后上样测定，测试结果见下图。

测定结果表明，在上述过程中均未检测到克伦特罗，增加洗脱液体积后克伦特罗的回收率依然为零。产生这种结果的原因可能有（1）克伦特罗没有被洗脱下来；（2）氮吹过程中损失；（3）复溶时没有溶解。针对后两种原因，直接将标准工作溶液进行氮气吹干，然后用水复溶，测定结果表明，氮吹和复溶过程对回收率的影响较小，那么只用一种可能，那就是克伦特罗没有被洗脱下来，仍然吸附在填料上面。增加洗脱液体积也没有效果，只能更换洗脱液了，参考文献方法用氨水-甲醇-乙酸乙酯溶液（体积比5：45：50）进行洗脱，效果并不理想。经过一系列的尝试，最后发现氨水有问题，原先使用的氨水开瓶时间较长，用的只剩下一点了，而且氨水具有挥发性，降低了氨水的浓度，导致洗脱液的碱性不够，于是找了一瓶新的氨水，重新配制氨水-甲醇洗脱液溶液，再次实验发现克伦特罗的回收率提高至90%左右。

案例二、淋洗液对回收率的影响- WCX固相萃取柱净化测定克伦特罗
实验方法：依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将加标的蜂蜜样品提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL 甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10氨水-甲醇溶液（体积比5：95）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。
说明：在建立固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗残留量方法时，采用WCX固相萃取柱对加标的蜂蜜样品进行净化并测定，发现回收率较低，只有60%左右。
发现问题：采用高浓度的标准工作溶液稀释后直接上样过WCX固相萃取柱，按照上述方法进行净化，分别收集过柱液、淋洗液和洗脱液，并分别对上述3种液体进行测试。过柱液和淋洗液不浓缩，直接上样测定，洗脱液中由于含有氨水，浓缩后上样测定，测试结果见下图。

测定结果表明，采用甲醇进行淋洗时有部分克伦特罗被洗脱下来，从而影响了最终的回收率，因此采用极性较低的乙醇进行淋洗，回收率提高到90%以上。
案例三、试剂空白对回收率的影响-MIP-BAP固相萃取柱净化测定苯并芘
采用MIP-BAP固相萃取柱净化测定食品中苯并芘含量时，发现试剂空白中检出了苯并芘，微量的试剂空白对高浓度的样品或许影响并不明显，但是对于低浓度的样品就会产生较大的误差，在低浓度加标时很可能出现回收率偏高的现象。排查方法和排查过程参考帖子：http://bbs.instrument.com.cn/topic/6025769
案例四、环境条件对回收率的影响
通常固相萃取柱对保持条件、使用温度和保质期都没有太多的要求，但是有些固相萃取柱，需要在规定的条件下保存和使用，否则就可能影响回收率。例如，免疫亲和柱对储存和使用温度有明确的要求，通常要求在2-8℃储存，但是千万不可冰冻保存，而且在使用前需要恢复至室温25℃左右，否则就可能影响免疫亲和柱的回收率。

案例五、流速对回收率的影响
上面已经讨论过流速对回收率的影响，这里再举一例。
在使用免疫亲和柱净化样品的步骤中通常要求在洗脱前使2~3mL空气通过柱体，但是这一步骤很容易导致填料萎缩，如果洗脱速度太快，洗脱液不能充分润湿填料，则可能出现回收率较低的现象，如果洗脱液沿着柱管直接流出来，则回收率可能只有零。因此洗脱时可以先堵住柱管的流出端，使得洗脱液充分润湿填料，使得填料重新舒展开后再进行洗脱。说明书中标明流速需要控制在1滴/秒。

案例六、填料与洗脱体积对回收率的影响
填料的规格、类型都可能对回收率有影响，在建立固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗残留量方法时比较了填料对回收率的影响（帖子链接：http://bbs.instrument.com.cn/topic/6585726_1），免疫亲和柱的产品说明中也明确规定了柱容量。如果上样液中目标组份含量超过固相萃取柱的吸附容量时则会出现吸附“过载”的现象。“过载”不一定非要上样液中目标组份含量高，如果上样液中杂质组份也能吸附在填料上，则会对目标组份产生竞争吸附，降低固相萃取柱对目标组份的吸附量，从而影响回收率，因此并非所有的样品经过简单提取后都可以直接上样，有时对上样液也要进行预处理。
将目标组份从固相萃取柱上洗脱下来时，不仅要考虑洗脱液的强度，同时要考虑洗脱液的体积，体积太少目标组份不能充分洗脱，影响回收率，洗脱体积太大，影响后续浓缩的时间。固相萃取柱规格、上样量和洗脱液体积之间的关系可以参考下表。

小结
（1）在对回收率问题进行排查时，不要选择样品的提取液做为上样液，因为可能会有竞争吸附和测定时杂质干扰的现象，可以直接选择高浓度的标准工作溶液甚至储备液上样测定，如果过柱液中检测出目标物质，需要考虑固相萃取柱“过载”，适当降低上样液浓度。如果是要考察柱容量，则需要选择高浓度的上样液，并让填料充分吸附；
（2）固相萃取过程仅仅是影响回收率的一个因素，样品的提取、浓缩以及复溶过程都可能影响回收率，当实验结果显示回收率异常时，需要从多方面进行排查；
（3）以上均属个人经验之谈，非常浅显地探讨了固相萃取过程中经常会遇到的问题，内容中不正确的地方，欢迎批评指正，共同学习。
本文部分内容来源于《ProElut固相萃取技术与应用》，该书开篇部分对固相萃取做了非常详细的阐述，个人觉得很有学习的价值，推荐给大家，共同学习。

附件：

ProElut_固相萃取技术与应用（第二版）.pdf