主题：【第十一届原创】食品微生物检测日常管理及质量控制

文/姜文生（华测检测 食药农化事业部）

      食品微生物检测是运用微生物学的理论与方法，检验食品中微生物的种类、数量、性质及其对人的健康的影响，以判别食品是否符合质量标准的检测方法。食品微生物检验是贯彻"预防为主"的方针，可以有效地防止或者减少食物人畜共患病的发生，保障人民的身体健康。食品微生物检验是衡量食品安全的重要指标之一，也是判定被检食品是否食用的科学依据之一。为了提高微生物检测的工作质量，保证检测结果的真实、准确，实验室需要加强微生物检测的质量控制工作。

      为了保证微生物检验结果的准确性和可靠性，微生物实验室必须建立完整的质量控制体系，充分考虑到影响检验结果的因素并加以控制，提高微生物检验工作的质量。影响检测结果的主要因素包括如下部分：
1 人员
与理化领域检测相比较，微生物检测更依赖工作人员的认知能力，因此，微生物检测人员应具有相应的微生物专业教育或培训经历，具备相应的资质和能力，能够正确理解标准并正确的实施检验，掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识；在检验过程中能遵守相关安全措施的规定，确保自身安全；有颜色视觉障碍的人员是不能参与涉及辨色的实验的；微生物检测人员要求数量要充足，要有一定的学习能力，正确的工作态度和强的责任心。
人员管理上首先要识别岗位的需求，招聘合适的人员，对人员进行管理要求和相应专业知识的培训及考核评价，对其能力进行确认后，进行授权及上岗，工作期间，要对其的专业知识和技术的持续能力进行确认，所有记录均需要归入人员的技术档案中。
2 设备
实验设备应满足检测工作的需要。设备所处环境适宜，便于维护、清洁、消毒与校准，并保持整洁与良好的工作状态；定期进行检查、检定（加贴标识）、维护和保养，以确保工作性能和操作安全。日常的监控和使用要有记录。避免起因于仪器的交叉污染，适当的时候对所使用的仪器设备和重复使用的玻璃器具进行清洁和灭菌。
设备管理除上述要求外，还要求设备有相应的管理制度和操作的作业指导书，授权操作，并建立设备档案。
2.1 常用主要设备日常管理中注意的事项如下：
l 高压灭菌锅：要定期校准，关注时间和温度是否满足要求；按照规定期限进行灭菌效果的验证，验证的方式有生物指示剂和化学指示剂两种。
l 超净工作台：要定期进行校准，关注气流，紫外强度是否满足要求；按照规定的期限采用平板沉降法等方式进行微生物的检测，采用紫外辐照计对紫外灯辐照强度是否满足要求进行检测。
l 生物安全柜：要定期进行校准，关注气流，紫外强度是否满足要求；除按照超净台的要求进行日常的监控外，还要定期更换滤网，确保设备运行的有效。
2.2 标准菌株管理
标准菌株作为微生物检测特殊的一类设备，需要进行严格的管控，双人双锁进行管理，确保可溯源，应有文件化的程序管理标准菌种（原始标准菌种、标准储备菌株和工作菌株），涵盖菌种申购、保管、领用、使用、传代、存储等诸方面，确保溯源性和稳定性。每一支标准菌种都应以适当的标签、标记或其它标识方式来表示其名称、菌种号、接种日期和所传代数，要定期进行期间核查，核查的指标包括：存活性、纯度、检验关键诊断指标等。根据标准菌株的危害级别，分别于相应级别的生物安全实验室进行操作，废弃时需要进行灭活处理。标准菌株的基本作用如下：
a)用于实验室的内部质量控制，证明结果的准确性；
b)证实方法的有效性，评价检测方法的准确度；
c)用于培养基及试剂的验收；
d）制备实验室的内部质控样品。
3 培养基和试剂耗材
实验室要有培养基和试剂耗材进行验收、接受/拒收和贮存的程序和标准，对每一批新购入的培养基和试剂耗材进行验收，确保其在检测过程中满足检验的要求。具体的验收方法依据GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》进行；对于检测过程中所使用的培养基及相关试剂、质控材料等要建立相应的台账，记录批号、实验室接收日期及投入使用的日期等，确保试剂耗材的先进先出。
4 检测标准和方法
微生物检测选择方法的优先顺序为：
a)客户指定的方法；
b)法律法规规定的标准方法；
c)国家标准、国际标准；
d)行业标准、地方标准、标准化主管部门备案的企业标准；
e)非标方法、允许偏离的标准方法。
无论选择那种方法进行检测，在使用前均需要进行方法验证和确认，通过人员培训和能力确认、设备配备、培养基、环境条件等方面的确认，阳性对照等模拟样品的检测，确保采用的方法能够正确的在实验室得以实施。
5 环境要求
实验室的工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要，实验区域应与办公区域明显分开，布局应采用单方向工作流程，避免交叉污染和影响检验结果的准确性；实验室内环境的温度、湿度、照度、噪声和洁净室等应符合工作要求；食品样品检验应在洁净区域进行，洁净区域应有明显的标识，洁净室的评价可参考GB 50333-2002《医院洁净手术室建筑技术规范》和GB 50687-2011《食品工业洁净用房建筑技术规范》的要求。病原微生物分离鉴定工作应在二级以上生物安全实验室（Biosafety level 2,BSL-2）进行，避免对人员造成的伤害；生物安全二级实验室的评价可依据GB 50346-2004《生物安全实验室建筑技术规范》要求进行；要定期通过空气沉降和表面擦拭等方法，对洁净室和生物安全实验室的洁净度进行监控并记录。
6 测试过程的要求
6.1 样品采集和交接
样品采集时必须无菌操作，避免杂菌污染。盛装检样的容器要确保洁净无菌，避免破碎，确保安全。采集完毕后需对样品进行标识，注明样品信息，编号等关键信息；并在规定的时间内（一般不超过3～4h）送达实验室，有特殊运输要求的样品需按照要求进行运送。样品交接时，样品接收人员要核对样品的数量和状态是否满足要求，样品满足要求的，样品接收人员方可在样品交接单上签字，同时进行检样登记。不满足要求的样品必须拒收并予以记录。
6.2 检测过程的控制
微生物检测过程开始前，要对洁净区进行消毒灭菌，培养基要进行充分的灭菌，所用的器材，必须清洁无菌。进入无菌室前所有的准备工作要充分，避免因物品准备不足而反复进出洁净室。
检测过程要依据客户及标准要求的方法进行，注意操作的规范性，整个检测过程的时间不宜过长，同时要避免交叉污染。
检测过程中的日常质量控制方式包括：阴性对照、空白对照、阳性对照。
检测工作结束后，要及时清理洁净室和生物安全实验室，对检测剩余的样品进行单独的存放，待报告出具后，再进行相应的处理。若有阳性检出的样品，需进行无害化处理；检测过程用到的器具需进行灭菌后再清洗，检测过程中产生的增菌液等需进行灭菌后处理。
6.3 报告出具
通过空白等质控方式严谨地分析实验结果，真实准确的记录实验数据，判定检测结果的合理性，出具准确可靠的报告。
除了上述各要素的控制外，实验室还可以通过实验室内部质量控制和实验室外部质量控制对微生物的检测过程进行控制。
实验室内部的质量控制手段要依据微生物检测的项目类别、检测频次，人员能力等编制实验室内部质量控制计划，内容包括项目、频次、评价方式和评价依据等，微生物检测的主要质控方式有空白试验、质控样品、实操考核、比对实验等方式。常用的质控手段的评价方式如下：
空白试验用来监测环境和操作过程的规范性，如空白试验有生长，则证明检测环境或检测过程不满足要求，实验失败。
质控样品是由质控样品提供者给予参照值，实验室进行检测后，与参照值进行比较，评价是否在质控样品参照值允许的范围内，如在允许的范围内即为合格，如超出允许的范围，则证明检测过程不合格，检测过程异常。
实操考核是指由质量监督员等对检验员针对考核的项目制定考核评价表，对操作过程进行打分，最终依据总得分判定被考核人员的能力是否满足要求。
比对实验一般是指用同一方法检测同一样品、由相同或不同的操作者使用相同或者不同设备所得到的两个单次实验结果进行比较，来评价人员操作的重复性和复现性是否满足要求，比对的评价可参考ISO 4833-1:-2013或SN/T 1800-2006，即：
重复性：使用相同方法，在同一实验室检测同一种物质，由同一操作者使用同一操作者使用同一设备在短时间内的两次独立的单次结果（以10为底的每毫升中微生物计数的对数）的绝对差值，不应大于重复性限，r=0.25（概率为95%的重复性临界差），
复现性：用同一方法检测同一样品、在不同实验室由不同操作者使用不同设备所得到的两个单次实验结果（以10为底的每毫升中微生物计数的对数）之间的绝对差值，不应大于复现性限，R=0.45（概率为95%的再现性临界差）。
例如：
A=3*10⁵CFU/g；      B=7*10⁵CFU/g
如A和B的检测结果为同一人，则A与B两次检测结果是否有差异？如A和B的检测结果非同一人，则A与B两次检测结果是否有差异？
评价结果如下：
Log₁₀A ≈ 5.47，Log₁₀B ≈ 5.85， Log₁₀A -Log₁₀B ≈ 0.37
如A和B的检测结果为同一人，则依据重复性测试要求A与B两次重复检测结果计算所得0.37>0.25,两次测试的结果存在有差异；如A和B的检测结果非同一人，则依据复现性测试要求A与B两次检测结果计算所得0.37<0.45,则A和B两人的测试的结果不存在差异。
实验室外部的质量控制手段主要测量审核和能力验证。测量审核是有资质的能力验证组织方组织的“一对一”服务活动。组织方提供样品，给出样品的中位值和范围，将参加者的结果与之比较，在范围内为合格，否则不合格;能力验证是有资质的能力验证组织方组织的“一对多”能力验证活动。多个实验室收集的数据进行统计分析，结果评价一般以Z值或En表示。当∣Z∣≤2时，结果满意；2<∣Z∣<3 结果可疑；当题∣Z∣≥3 结果离群，不满意。当∣En∣≤ 1 结果满意，当∣En∣>1时，结果不满意。
总之，完善的实验室管理体系，良好的质量控制，才能保证检测结果的准确行和可靠性。