主题：【第十二届原创】泽泻多糖的提取工艺的优化

摘要：
目的：探索提取温度、液固比和提取时间对泽泻多糖产率的影响，得到提取泽泻多糖最优工艺条件。方法：用均匀设计实验优化泽泻多糖的提取工艺，用苯酚硫酸法测出每次实验所得多糖的纯度，再求得每次实验纯多糖的得率，然后应用回归分析的方法分析实验得出的数据，以纯多糖的得率为指标，对提取温度、液固比、提取次数和提取时间3个因素进行分析，得出最佳工艺条件，并进行验证。结果：实验得出茵陈多糖的最佳提取条件是：提取温度100℃、提取时间135 min、提取液固比40:1。结论：验证实
验平均得率为8.83%，预测值是8.28%，二者很接近，说明我们得到的最佳工艺条件是可靠的。
1前言
泽泻为泽泻科植物泽泻Alsima orientalis(sam.)Juzep.的干燥块茎，分布在中国、韩国和日本等国。性味甘、淡、寒，归肾、膀胱经。作为常用中药，是六味地黄丸、龙胆泻肝丸、五苓散等临床常用重要方剂的主要组成。具有利水渗湿，泄热，化浊降脂等功效，用于治疗小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰饮眩晕，热淋涩痛，高脂血症等症。
1.1泽泻的化学成分
泽泻中的三萜类化合物主要有：泽泻醇A、泽泻醇A-24-乙酸酯、泽泻醇B-23-乙酸酯、表泽泻醇A、11-去氧泽泻醇A、泽泻醇C、泽泻醇C-23-乙酸酯、16，23-氧化泽泻醇E、泽泻醇F、阿里泽泻醇A和阿里泽泻醇B等原萜烷型四环三萜。从生物途径归纳，三萜类都是由 23- 泽泻醇 B 衍生而来。中药泽泻中获得的倍半萜类化合物多数为愈创木烷型。现分离到的倍半萜化合物主要有：泽泻醇，环氧泽泻烯，Orientalol A，B，C，Sulfooriental A，B，C，D。Yamaguchi等首次从泽泻鲜品中分离出一个贝壳杉烷型四环二萜类化合物，并最终确定了绝对构型为(-)-16R-ent-kauranre-2,12-doine。彭国平等从泽泻中分离出两个新的贝壳杉烷型四环二萜类化合物：泽泻二萜醇(Oriediterpenol)及泽泻二萜醇苷 (Oriediter-penoside) 。
泽泻除了萜类成分外，此外，泽泻还含挥发油、多糖、蒽醌、磷脂、蛋白质及淀粉等成分。如胡萝卜素-6-硬酸脂、β-谷甾醇、三十烷、正二十烷、卫矛醇、挥发油(内含糖醛)、少量生物碱、天门冬素、脂肪酸、树脂、植物凝集素、大黄素、酸性多糖，胆碱，以及大量淀粉、蛋白质、氨基酸和钾、钙、镁等金属元素。
1.2　泽泻的药理作用
现代研究表明，泽泻有明显的利尿，抑制肾结石形成，降血压，降血脂及抗动脉粥样硬化，抗脂肪肝，抗肾炎活性和调节免疫等作用。
1.3立题依据
多糖具有多种生物活性, 具有提高免疫, 降血糖，抗肿瘤, 抗病毒等功能, 被认为是构成生命的四大基本物质之一。由于其独特功能和较低的毒性, 多糖类化合物在抗衰老、 抗病毒和肿瘤治疗、 糖尿病治疗等方面有良好的应用前景。另外,多糖可以改善食品的食用品质、加工特性和外观特性, 可用于抑制脂质氧化, 稳定酸性饮料, 也可作为乳化剂等, 在食品中的用途十分广泛。
目前已发现的天然多糖有几百种，其中植物多糖对肿瘤治疗及调节机体免疫力效果显著，同时还有治疗肝炎、抗衰老等药理作用，且毒副作用很小。由于泽泻的药理作用显著，而关于泽泻多糖研究的文献很少，因此对于泽泻多糖的研究也具有很大的意义。开发泽泻多糖产品，首先需要把多糖从泽泻中提取出来。笔者决定对泽泻多糖的提取工艺进行研究，对其提取条件进行优化，从而为泽泻多糖的深入开发利用提供实验依据。本课题我们就重点探讨泽泻多糖的最佳提取条件，通过对泽泻多糖提取过程中影响泽泻多糖产率、纯度的因素进行单因素实验，然后进行均匀设计实验，用线性回归的分析方法分析实验得出的数据，寻找泽泻多糖的最优化工艺条件。
1.4提取方法的确定
提取植物多糖的方法有多种，一般是采用水提醇沉法，采用水提醇沉法提取，可防止引起糖苷键的断裂。李小凤等通过单纯的水提醇沉法对泽泻多糖进行了提取和含量测定。此外,很多研究对多糖的水提醇沉工艺做了优化，如朱秀灵等采用超声波辅助提取银杏叶多糖；缪建等采用酶法结合水提醇沉法提取银杏叶多糖；金汝城等采用均匀设计优化超声波法提取黄芪多糖。由于实验设备有限，本实验采用水提醇沉法对泽泻多糖进行提取。
2　　实验材料
2.1实验仪器
FA2104N型电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）
HH-1数显恒温水浴锅（金坛市晶玻实验仪器厂）
80-2离心机(上海荣泰生化工程有限公司)
RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）
GZX-9070电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）
DZF-6050真空干燥箱(巩义市予华仪器责任有限责任公司)
SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵（保定市新区阳光科教仪器厂）
BCD-223MT冰箱（河南新飞电器有限公司）
722可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）
24目，100目标准筛（浙江上虞市华丰五金仪器有限公司）
2.2实验材料和试剂
泽泻（河北省安国药材市场）
无水乙醇（分析纯，天津市美琳工贸有限公司）
蒸馏水（实验室自制）
葡萄糖（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）
苯酚（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）
浓硫酸（分析纯，北京化工厂）
３实验方法
3.1泽泻粗多糖的提取流程
将预备好的泽泻放入70℃真空烘箱中干燥2h，粉碎取过24目筛，不可过100目筛的粉末，装在密封袋中置于干燥器中备用。
泽泻多糖提取的实验流程如下：
精密称定已制备的泽泻粉末5.000g于500mL圆底烧瓶中，加入规定液固比的蒸馏水，用恒温水浴锅T℃水浴加热不同时间，先用脱脂棉过滤得粗滤液，然后用布氏漏斗抽滤粗滤液，通过旋蒸仪旋转蒸发将所得滤液浓缩至约10mL，加95%乙醇30mL，置具塞锥形瓶中，冰箱4℃放置约18h，然后用10mL试管离心（3000rpm，10min），弃去上清液，得沉淀，于50℃、0.099MPa真空干燥箱中放置3.5h后，关闭电源，真空放置过夜。然后，将所得沉淀与离心管一起称重，通过差量法计算多糖产率。
其中，液固比、水浴温度T、提取时间t及提取次数根据实验过程中考察因素的改变，作相应更改。
粗多糖产率=粗多糖质量／泽泻样品质量×100%
3.2　泽泻纯多糖含量的测定
本课题中，泽泻提取工艺最佳条件分析中所用的是纯多糖含量，粗多糖的数值只是作为参考数值。本实验中是通过苯酚-浓硫酸反应使多糖显色，在紫外可见分光光度计490nm处测得吸光度，然后通过将数据代入当天测得的标准曲线中，计算出相应多糖浓度，从而计算出不同提取条件下泽泻中纯多糖的含量。
3.2.1　标准曲线的绘制
标准液的配制：称取葡萄糖0.1259g于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀得1.259g/L的储备液，分别精密量取储备液1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL，置于25mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀。则得五个不同浓度的标准液。
配制5%苯酚溶液：称取苯酚1.2508g于烧杯中，用加热至约50℃的蒸馏水溶解，转移至25mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，避光保存以备用。
标准曲线的绘制：取2mL移液管，分别取2mL蒸馏水和五个标准溶液于六根具塞试管中，再用移液枪移取1mL5%的苯酚溶液，快速加入上述具塞试管中，充分混匀，用5mL移液管取5mL浓硫酸快速加入上述试管中，盖好试管塞，充分摇匀。从放入沸水浴中计时，沸水浴15min，冷水浴10min，室温放置5min（六个溶液之间间隔3min加硫酸）。将上述反应30min后的溶液分别在490nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以葡萄糖标准溶液C(Co=50.36)为横坐标，绘制标准曲线。（见图1-1）
标准曲线的线性范围为：0.10072×10^-4g/mL ~0.50360×10^-4g/mL
曲线方程：A=0.0165C-0.0216，相关系数：r=0.9998

图1-1    标准曲线

3.2.2　苯酚-浓硫酸法测多糖含量
分别取不同提取条件下所得粗多糖0.040g于小烧杯中，加少量温水搅拌使其溶解，转移至250mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。使用前用布氏漏斗抽滤，滤去不溶物，得澄清滤液。然后用2mL移液管分别移取2mL上述滤液于具塞试管中，再用移液枪移取1mL 5%的苯酚溶液，快速加入上述具塞试管中，充分混匀，用5mL移液管取5mL浓硫酸快速加入上述试管中，充分摇匀，盖好试管塞。沸水浴15min，冷水浴10min，室温放置5min，反应完全后在490nm处测定其吸光度，每次需配制空白对照用来校正可见分光光度计。将测得的吸光度带入标准曲线方程中计算出所配溶液的多糖浓度，进而可计算出纯多糖的产率。
3.2.3　纯多糖产率的计算
纯多糖产率=（纯多糖浓度×体积×粗多糖质量）／（粗多糖测样量×泽泻质量）×100%
3.3　单因素实验
3.3.1　液固比对泽泻多糖提取率的影响
考察液固比，是为了能够在使用较少溶剂的情况下提取出最多的多糖，这不光能够减少工业生产中单位产量水的使用量，同样也为多糖提取液后期处理减少了时间和成本，具有重要的经济和生态效益。在结合前人相关中药材多糖提取实验的基础上，确定考察液固比为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1。纯多糖产率见表3-1。

                    表3-1　　液固比对多糖提取率的影响     

提取温度	80℃	提取时间		2.5h	提取次数		1
液固比（mL/g）	10:1		20:1		30:1	40:1	50:1
多糖产率(%)	3.38		3.46		5.43	7.87	6.81

3.3.2　提取温度对泽泻多糖提取率的影响
中药材提取过程中，温度是极其重要的条件。通过查阅文献及综合各方面考虑，确定提取温度为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。多糖产率见表3-2。

表3-2　　提取温度对多糖提取率影响

液固比	20:1	提取时间		2.5h	提取次数		1次
提取温度	60℃		70℃		80℃	90℃		100℃
多糖产率(%)	1.81		2.87		4.55	5.75		9.57

3.3.3　提取时间对泽泻多糖提取率的影响
通过查阅文献，本实验确定考察时间为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h。多糖产率见表3-3。

表3-3    提取时间对多糖提取率的影响

液固比	20:1	提取温度		80℃	提取次数			1次
提取时间（h）	0.5		1		1.5	2	2.5	3	3.5
多糖产率（%）	3.57		3.38		4.75	5.04	5.00	4.55	5.15

3.3.4　提取次数对泽泻多糖提取率的影响
众所周知，在最合适的料液比、提取温度、提取时间条件下，提取次数越多，药物的有效成分在中药材中溶出的就会越多，提取率相应就会越高，但提取次数决定操作成本，提取次数越多，成本越高，且工艺用水量大。所以根据前人提取数据，将提取次数定为1次、2次、3次。多糖产率见表3-4。

表3-4    提取次数对多糖提取率的影响

提取温度	80℃	提取时间		2.5h	液固比	20:1
提取次数	1		2		3
多糖产率（%）	3.46		5.71		8.68

3.4  均匀设计实验
3.4.1　均匀设计实验方案
在泽泻（均为5g干粉）多糖提取工艺中，我们要考察的主要因素有：提取温度、料液比及提取时间三个因素。根据单因素实验结果确定各因素的取值范围：提取温度X₁ :55℃~100℃；料液比X₂：1:15~1:60：提取时间X₃：1.5h~3.75h。再根据各种因素的取值范围、试验精度要求，按提取温度间隔5℃，液料比间隔5，提取时间间隔0.25h，设计出一个3因素10水平的均匀设计表。根据均匀设计表中所列的提取条件，按照泽泻粗多糖的提取流程，对泽泻粗多糖进行提取，并计算其产率。（见表4-1）提取得到粗多糖并测定多糖纯度，进而求得纯多糖产率。

表4-1　　均匀设计实验数据

条件 编号	温度（℃）	料液比   （g/mL）	时间（min）	粗多糖产率(%)	纯多糖产率(%)
1	55	1:35	180	14.24	1.22
2	60	1:60	120	15.44	1.67
3	65	1:30	225	12.72	1.27
4	70	1:55	165	14.94	2.50
5	75	1:25	105	13.62	3.74
6	80	1:50	210	23.82	6.55
7	85	1:20	150	23.19	5.98
8	90	1:45	90	23.05	5.71
9	95	1:15	195	16.52	4.92
10	100	1:40	135	39.93	8.74

3.4.2　最优提取条件的选择
用SPSS 19.0统计软件，以纯多糖得率为评价指标对各因素进行线性回归分析，模型的优度通过复相关系数和方差分析来判定。结果如表4-2。

表4-2　　回归方程

	回归方程式	R	P
回归方程1   回归方程2   回归方程3	Y＝-9.850+0.164X1+0.033X2+0.001X3   Y＝-7.595+0.153X1   Y＝3.780-0.002X2  X3+3.004E-5 X1X2 X3	0.919   0.902   0.960	0.008   0.000   0.000

表4-2中，Y为纯多糖得率，X1为提取温度，X2为液固比，X3为提取时间。方程1，R²＝ 0.844，P值为0.008，回归非常显著，常数项和X1项P值分别0.041和0.002小于0.05 ，回归显著，有统计意义，而X2，X3均回归不显著，方程1多糖产率预测值为7.98%；方程2为将各项及其交叉乘积项全部纳入进行逐步回归的结果，我们发现，最后的方程中只保留了X1项，方程2的 R²＝ 0.813，常数项和X1项P值分别为0.006和0.000，均小于0.01，回归亦非常显著有效，其预测值为7.66%。方程3为全体向后回归分析结果，R²＝ 0.922，P值为0.000，常数项乘积项P值分别为0.001，0.000和0.000，均小于0.01 。故回归非常显著，其预测值为8.28%。
3.4.３　最优提取条件的验证
综合上述三方程的回归结果，及均匀设计和单项实验的结果，我们采取提取温度100℃、提取时间为135 min、提取料液比为40，即第10组的条件为最佳条件，并重复3次进行实验验证。结果见表4-3。

表4-3　　最优提取条件测得的多糖含量

实验编号	提取条件	粗多糖得率（%）	纯多糖得率（%）
1	提取温度：100℃   料液比：1:40   提取时间：135 min	32.24	8.57
2		28.64	8.99
3		28.99	8.92
平均值		29.96	8.83

４　　实验结果

4.1　单因素实验结果
4.1.1  　液固比
采用提取温度80 ℃，加热2.5h，提取1次，考察了液固比对提取收率的影响。图4-1表明，固液比从10:1增到20:1多糖产率并无太大变化，液固比从20:1增到30:1纯多糖产率提高了56.94 %，同样，从30:1到40:1纯多糖产率又提高了44.94%。而在40:1到50:1之间，反而下降。主要是由于开始增加提取液体积有利于细胞内容物的溶出，而液固比到达40:1之后，多糖成分已基本溶出，故多糖产率并没有提高，反倒降低。考虑到工业生产中水的用量和多糖产率的综合因素，可以得出40:1应为最佳提取液固比。

图4-1　　液固比对泽泻粗多糖得率的影响

4.1.2  　提取温度
采用液固比为20:1，提取时间2.5h，提取1次，考察了提取温度对多糖产率的影响，结果见图4-2。由图中可以看出，当温度从60 ℃上升到70 ℃时，粗多糖得率共提高了58.56%，从70℃到80℃，提高了58.54%，80℃到90℃，提高了26.37%，从90℃到100℃，提高了66.43%。随着温度的上升，多糖产率一直在增加，说明温度的提高对多糖的溶出有显著影响。显然，从60℃到90℃，多糖产率几乎呈线性上升，从90℃到100℃，较60℃到90℃上升更快，且产率最高。过低的温度会造成提取物溶出少甚至不溶出，而较高温度会显著提高多糖产率。所以，即使较高的温度会略微增加能源上的成本，但是却使多糖产率增加数倍，提高药材利用率，大大降低总生产成本。综合以上各方面因素考虑，得出多糖的最佳提取温度为100 ℃。

图4-2　　提取温度对泽泻多糖得率的影响

4.1.3  　提取时间
中药材有效药物成分溶出需要一定的时间，较短会造成药物有效成分无法最大限度地溶出，过长的提取时间则会导致有效成分分解。采用提取温度80 ℃，液固比20:1，提取1次，考察了提取时间对多糖得率的影响，结果见图4-3。可以看出，提取时间超过2h后多糖得率并未继续增加，反而下降；而2h之前，多糖得率增加显著，从1h到2h增加了49.11%。虽然在3.5h处总产率较2h增加了0.11%，但是提取时间却较2h多出将近一倍，大大增加了生产成本，故2h为最佳提取时间。

图4-3　　提取时间对泽泻多糖得率的影响

4.1.4  　提取次数
采用提取温度80 ℃，提取时间2.5h，液固比20:1，考察了提取次数对多糖得率的影响，结果见图4-4。结果发现：提取3次时多糖得率最高，比1次提取提高了1.5倍，差别显著。而提取两次较提取一次，也提高了65.03%，提高显著。提取三次的多糖产率是提取一次的2.5倍。因此，从约成本，提高药材利用率的角度考虑，确定最佳提取次数为3次。

图4-4　　提取次数对泽泻多糖得率的影响

4 . 2　均匀设计实验结果
本实验采用水提醇沉法提取泽泻多糖，通过对料液比、提取时间、提取温度等三个可控条件进行均匀设计实验，结合实验及生产实际，确定了泽泻多糖提取的最优条件，并利用该最优条件测定了泽泻多糖的含量，计算出了纯多糖的得率。结果见表4-4。

表4-4　　泽泻多糖提取最优条件及多糖含量

最优提取条件				粗多糖得率   （%）	纯多糖得率   （%）
提取温度	提取料液比	提取时间	提取次数
100℃	1:40	135 min	1次	29.96	8.83

所得纯多糖实际产率8.83%与理论得率8.28%十分接近。

5　　讨论
5 . 1多糖提取与含量测定过程
（1）在多糖提取过程中，除待测因素温度、料液比、提取时间按要求改变外，其他条件均应保持一致,以减少系统误差，增加数据的准确性。
（2）在转移多糖溶液的过程中要尽可能的减少损失及其操作的一致，如粗过滤完抽滤时滤渣滤棉中残余多糖成分的转移，旋蒸浓缩提取液后的转移和离心过程中多糖的转移应最大程度减少多糖损失量，并保持操作的一致性。
（3）在绘制标准曲线及用苯酚-硫酸法测多糖含量时，加入苯酚后一定要混匀，以防止硫酸直接氧化苯酚，导致糖类反应不完全。此外，苯酚须现用现配，避光保存。
（4）在硫酸与糖反应时，一般方法是加入苯酚和硫酸后摇匀，直接室温放置30min后测其吸光度，为了保证反应完全，本实验在加入硫酸并摇匀后，先沸水浴15min，再冷水浴10min，再室温放置5min后测量吸光度。并在测量时保证每组的反应时间一致。
（5）纯多糖含量的测定过程，为了保证数据的准确性，单因素实验中同一组的最好同时测，均匀设计实验的十组最好同一天测完。
（6）由于实验时间有限，对于泽泻多糖测定时，采用的是以往经验的可见光范围490nm进行测定，这是实验中不完善的地方，准确的操作应通过实验找到多糖吸光度最大的波长进行测定。
5 . 2　单因素实验
由于单因素只是考虑单个提取条件对产率的影响，不能考虑到多种因素共同的影响，所以只是作为参考结果，对于单因素对多糖提取的影响具有参考价值，但是从总的生产上来说，均匀设计具有更加实用的价值。本实验中，单因素最优条件为：液固比40:1，提取温度100℃，提取时间2h，提取次数3次。
单因素中提取次数的结果中提取两次较提取一次产率的增长值，还没有提取三次较提取两次的增长值大。可能是因为提取温度不够高，多糖溶出较慢所致。单从单因素的角度来看提取三次为最佳条件。但是从生产过程考虑，提取次数的增加会增加很大工作量，一般会选择一次就能提取完全的条件。而均匀设计实验中也证明，在100℃，40:1,135min条件下多糖的产率就可以达到8.74%，比单因素实验中提取三次的量还要高，故选择一次为最佳提取次数。
5 . 3　均匀设计实验
均匀设计实验结果8.83%同实验分析的理论结果8.28%较为接近，这也证明了实验数据的准确性，并通过回归分析确定了实验的最佳提取条件。均匀设计是在单因素的基础上进行的，综合两个实验的数据结果，不难发现提取的最佳条件为：提取温度100℃、提取时间为135 min、提取料液比为40、提取一次。
5 . 4　整体结果讨论
单因素实验中，我们可以得到以下关于单因素对多糖提取率的影响。提取次数与多糖产率呈正相关，提取时间也是呈正相关。提取时间与多糖产率的关系是到一定时间就达到稳定，即超过这个时间显著性不过。液固比与多糖产率的关系是存在一个峰值，低于此值，产率随液固比增加而增加，超过此值则随液固比增加而产率降低。这也给我们一些启发，对于这些植物药中似多糖类水溶性物质的提取条件也应存在此种规律，可作为以后研究的参考。
均匀设计实验是在单因素的基础上，综合考虑了提取时间、温度和液固比对多糖产率的影响，是较符合实际生产条件的一项实验，具有较高的应用参考价值。当然，除了本课题中考虑到的因素，可能还有其他未被考虑到的一些因素。均匀设计只是以线性回归的方式对实验数据进行分析，而现在有更为先进的如响应面分析法等。这都说明多糖的提取工艺有很大的提升空间。
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