H7N9流感荧光定量PCR检测方法的模块化构建及实践

1 前言

流感病毒（influenza virus）属正粘病毒科，根据抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲型（A型）、乙型（B型）、丙型（C型）。乙型变异性较弱、丙型抗原性比较稳定，仅感染人类；甲型（A型）抗原变异性最强，感染人类和其他动物，常引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。

甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为18个亚型（H1～H18），N有11个亚型（N1～N11）。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。一般情况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。

据国家卫计委《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第1版）》载：“人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。自2013年2月以来，上海市、安徽省、江苏省先后发生不明原因重症肺炎病例，其中确诊人感染H7N9禽流感3例，2例死亡”。此后，国内及国际上发生多起人感染H7N9流感病例，成为公众关注度较高的传染病。

此后发现, 该病毒传播扩散有一定的季节性, 即好发于冬春季, 所以在疫情分析统计时, 世界卫生组织（WHO）建议, 从每年的10月1日至次年的9月30日作为H7N9的流行年度。

根据世界卫生组织、联合国粮农组织（FAO）及有关权威机构的报告, 截至2017年3月8日止, 人感染H7N9累计报告病例数1292例。第1波134例（2012~2013年）, 第2波304例（2013~2014年）, 第3波219例（2014~2015年）, 第4波118例（2015~2016年）, 第5波目前已报告517例（2016~2017年）, 疫情较为严重, 已达到总报告病例40.00%; 总体死亡435例, 病死率约为33.67%。大陆境内已有20个省（市、自治区）报告病例, 境外港澳台、马来西亚和加拿大各有报告从中国大陆地区输入的病例。新发生病例主要集中在东南沿海地区, 以江浙粤及其周边省份和地区的疫情为重。

一种动物传染病发生后，究竟采取什么防控措施，是实施扑杀还是免疫，要从多方面进行考虑：一是是否属于人畜共患病，二是该传染病的传播能力、危害程度，三是是否有经济、有效的疫苗，四是免疫成本。需要指出的是，对于非人畜共患病来说，免疫成本是个不得不考虑的重要因素。

假设某地有鸡场5万个，每个场产量2000羽，则每年产量1亿羽，每羽价值30元，则产值30亿元；假设某种不感染人的传染病，其发病率0.01%，即每年有5个场发病，采取全部扑杀的损失为5万个场*0.01%*2000羽/场*30元/羽=30万元，采取免疫的成本为1亿羽*0.5元/羽=5000万元，两者比较之下，采取扑杀措施更为经济，一般情况下以选择扑杀为主；如果发病率提高到2%，则扑杀成本为5万个场*2%*2000羽/场*30元/羽=6000万元，采取免疫的成本为1亿羽*0.5元/羽=5000万元，则采取免疫显得更为经济，如果预计发病率会持续升高，则大概率会选择免疫措施。

我国家禽饲养量巨大，2012~2016年出栏量基本维持在每年120亿羽左右，如果实施全面免疫，疫苗及免疫注射等直接成本在100亿元以上。而且在非免状态下，可以通过检测抗体等低成本手段予以监控家禽是否感染；一旦全面免疫，由于无法区分免疫抗体和感染抗体，则必须改用病毒核酸检测予以监控。据《兽医公报》数据，2016年全国共监测H7N9抗体96万多份，直接成本约50万元。如果全面免疫，改用荧光PCR监测，则需监测费用8000多万元。因此，在动物疫情可防、可控的情况下，多采用及时发现并处置疫情、避免疫情扩散蔓延为主要技术手段。

2017年初，部分省份发现家禽高致病性H7N9流感变异毒株，并引发多起家禽疫情。2017年6月，农业部决定在广东省和广西壮族自治区（以下简称两广地区）先行开展H7N9免疫工作。2017年秋季，农业部决定实施家禽H7N9流感全面免疫，通过采取免疫等综合防治措施，家禽H7N9流感病原学阳性率显著下降。

由于免疫并不能保证100%家禽受到保护，加上有多条全球鸟类迁徙路线经过我国，由野生禽类带来的环境污染及H7N9流感疫情还是不可避免有所发生。为确保公共卫生安全，以及畜牧业健康发展，有必要实施H7N9流感核酸监测，尽早发现疫情隐患并予以及时处置，避免重大动物疫情及公共卫生安全事件发生。

2 模块化检测方法思路

总体思路是：将动物疫病荧光定量PCR检测分为三个模块，核酸提取采用DNA/RNA共提试剂，核酸扩增采用预混液+引物探针方式，质控品利用抗原或商品化疫苗自制。具体思路如下：

——核酸提取采用DNA/RNA共提试剂；

——引物探针严格按照标准方法，委托生物工程公司合成；

——反应体系中其他成分，采购商品化RT-qPCR预混液（含逆转录酶）；

——质控品：阳性对照采用病毒抗原、商品化疫苗等，测定结果后按一定比例稀释，保存备用。

——反应体系：设为20μL，其中包含：预混液（2×）10μL、逆转录酶1μL、ROX 0.4μL为固定量，引物探针加入量根据检测标准中的终浓度予以换算，加灭菌水补足18μL，DNA或RNA模板为2μL；

——反应条件首先按照标准中的条件开展摸索，如达到预期效果则予以固定；如效果不佳则参照预混液及引物探针推荐条件进行适当调整。

3 材料和方法

3.1 病毒

禽流感血凝抑制抗原，包括H7、H7N9、H7N9Re-2等毒株。

3.2 试剂

DNA/RNA共提试剂盒：FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit试剂盒，南京诺维赞生产；

RT-qPCR预混液：2× One Step Q Probe Mix，南京诺维赞生产；

逆转录酶：One Step Q Probe Enzyme Mix，南京诺维赞生产。

3.3 引物探针

按照GB/T 35806-2018 《动物流感检测 H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法》提供的序列，委托上海生工合成，引物稀释成10μmol/L、探针稀释成5μmol/L，分装成小包装冷冻保存备用。具体序列如下：

检测H7基因引物探针序列：

正向引物：5'-AAAATAGAATACAGATWRACCCRGT-3'

反向引物：5'-GTGCACYGCATGTTTCC-3'

探针：5'-FAM-CTTCGGGGCATCATGTTTYMTWCTTCTRG -TAMRA-3'

检测N9基因引物探针序列：

正向引物：5'-CCAAATCAGAAGATTCTATGCACYT-3'

反向引物：5'-GGTTTGCYATTCCWATGARYA-3'

探针：5'-VIC-GCCACTGCYATYRTAATA-MGB-3'

3.4 反应体系

根据GB/T 35806-2018 《动物流感检测 H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法》所载反应体系，按照终浓度一致原则予以转化。具体转换方法：

——反应体系总体积设定为20μL；

——将标准中反应体系的10×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq酶、反转录酶等成分转换为RT-qPCR预混液10μL、逆转录酶1μL（推荐量）；

——因使用ABI7500荧光PCR仪，故在体系中加入ROX 0.4μL；

——标准中H7基因正向引物、反向引物、探针的终浓度分别为0.4μmol/L、0.4μmol/L和0.15μmol/L，N9基因正向引物、反向引物、探针的终浓度分别为0.5μmol/L、0.5μmol/L和0.2μmol/L，故在修改后的体系中加入量H7基因为0.8μL、0.8μL和0.6μL；N9基因为1.0μL、1.0μL和0.8μL；

——总RNA加入量修改为2μL（根据经验该加入量已经足够）；

——根据上述各成分用量，补充体积的无核酸酶水修改为1.6μL。

标准方法		修改方法
5RT缓冲液	5.0	2Χ RT-qPCR预混液	10
MgCl2(25mmol/L)	3.0	酶混合液	1
dNTP(10mmol/L)	1.0	ROX	0.4
H7正向引物(20μmol/L)	0.5	H7正向引物(10μmol/L)	0.8
H7反向引物(20μmol/L)	0.5	H7反向引物(10μmol/L)	0.8
H7探针(10μmol/L)	0.375	H7探针(5μmol/L)	0.6
N9正向引物(20μmol/L)	0.625	N9正向引物(10μmol/L)	1.0
N9反向引物(20μmol/L)	0.625	N9反向引物(10μmol/L)	1.0
N9探针(10μmol/L)	0.5	N9探针(5μmol/L)	0.8
M-MLV反转录酶(200U/μL)	0.5	总RNA	2
RNA酶抑制剂(40U/μL)	0.25	无核酸酶水	1.6
Ex Taq HS酶(5U/μL)	0.25	总体积	20
无核酸酶水	1.875
总RNA	10
总体积	25

3.5 反应条件

参照GB/T 35806-2018 《动物流感检测 H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法》推荐的扩增程序，结合ABI7500荧光采集时间不能少于34s的要求，进行预试验。扩增程序如下：

42℃30min → 94℃3min →(92℃15s→ 53℃10s → 60℃35s)*40

如扩增结果理想，则不做修改直接采纳，否则进行适当调整。

4 试验结果

对禽流感病毒包括H7、H7N9、H7N9Re-2等毒株均进行了核酸检测，结果均可接受。部分扩增曲线如下：

H7基因扩增曲线

N9基因扩增曲线

5 阳性质控的制备

根据GB/T 35806-2018 《动物流感检测 H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法》规定，阳性对照应H7基因及N9基因均Ct≤30。结合各抗原扩增情况，挑选了H7N9、H7N9Re-2两种抗原适当稀释后进行再次检测，结果如下：

稀释倍数	1:10^1	1:10^2	1:10^3	1:10^4
H7基因-H7N9	15.43	18.11	22.66	27.94
N9基因-H7N9	18.76	22.19	26.32	31.63
H7基因-H7N9Re-2	15.52	18.50	21.29	31.69
N9基因-H7N9Re-2	20.28	23.68	27.24	35.01

经综合判定，最后采用H7N9抗原作1: 10^3稀释，分装为200μL/管作为阳性质控，H7基因Ct值约23，N9基因Ct值约26，-70℃冻存备用。

6 讨论

6.1 检测工作更加方便高效

一是在核酸提取环节采用了DNA/RNA共提试剂，待检样品经一次提取核酸，除可应用于H7N9流感等RNA病毒项目检测外，还可应用于DNA病毒项目检测；

二是由于实验室储备了足够量的qRT-PCR预混液及逆转录酶，在开展检测时，不必担心部分检测量较少的项目由于试剂组分不足而罢工事件的发生；

三是由于qRT-PCR预混液及逆转录酶适用于多数RNA病毒项目的检测，在检测任务发生重大变化时，可以方便地调整检测项目，不必担心试剂不足或浪费情况的发生；

6.2 阳性质控品制备方便

动物疫病监测实验室常备禽流感血凝抑制抗原，并可根据病毒变异情况及时更新。只需对贮存的抗原进行含量测定，取合适的抗原进行一定比例的稀释即可作为实验室内部的阳性质控品。

6.3 适用性有待进一步验证

尽管在构建新方法时，对适用性进行了尽可能多的验证，但对于其他毒株，尤其是较新型的变异株是否有效，尚有待进一步观察和验证。

6.4 严格依法依规操作

如果有关法律法规或上级有关部门出台政策，要求采用获批准的成品试剂盒用于检测，则实验室必须及时停止自建方法的使用。