高效液相色谱仪SPD-10A（日本岛津），高效液相工作站LC Solution（日本岛津），检测器RF-10AXL（日本岛津），XDB-C18（Waters），2RS-4型智能溶出试验仪（天津大学无线电厂），2P-8型智能型旋转式压片机（上海天祥制药公司），PHS-3BW型数字酸度计（上海程达仪器厂），BS224S型电子天平（北京赛多力斯），YD-1型片剂硬度测试剂仪（天津市光学仪器厂），SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

药品

酒石酸托特罗定，羟丙甲基纤维素K₄M，羟丙甲基纤维素K₁₅M，微晶纤维素MCC，硬酯酸镁。

二、缓释片体外溶出度测定条件

溶出介质：经过脱气的水

温度：37±0.5℃

方法：桨法

转速：100rpm

体积：200mL

取样点：1h（2h）、6h、12h、24h

酒石酸托特罗定检测方法：

HPLC条件

色谱柱：C18 （5um，4.6×250mm）

流动相：20mmol/LpH3.0 NH₄AC 缓冲液：CH₃OH = 35 ：65

检测波长：283nm

流速：1ml/min

柱温：40℃

进样量：20uL

标准曲线范围：1—20ug

（《中国药典》C18柱，甲醇-缓冲液(取水500ml，加磷酸3ml，用二乙胺调节pH值至7.2)(80:20)为流动相，检测波长为282nm）

三、缓释片制备

制备工艺：酒石酸托特罗定、HPMC、MCC过80目筛混匀，加入硬脂酸镁过80目筛，60KN压片，直径12mm。

四、试验设计

　试验采用Box-Behnken 设计 ,在单因素考察的基础上 ,选取对缓释片溶出度影响较为显着的3个因素 ,即片剂处方中HPMC K₄M、HPMC K₁₅M与TT的比例 ,在3个水平上进行了优化研究 ,对缓释片溶出度进行数学方程拟合，分别以Higuchi方程的回归系数R值、一级方程的回归系数R值和零级方程的回归系数R值为响应值Y ,建立数学模型 ,优化TT凝胶缓释骨架片处方。实验中的3个因素: HPMC K₄M的含量,HPMC K₁₅M的含量, TT的含量 ,分别记作X₁, X₂, X₃,每个因素的低、中、高三水平分别记作 -1、0、+ 1。表1中列出了试验的各因素的各个水平。

表1 Box-Behnken实验设计的因素和水平

Tab 1 Factors and levels ofBox-Behnken design

Factors	Levels
Factors	-1 0 +1
X₁（%）	5	10	15
X₂（%）	5	10	15
X₃（%）	0.5	1	1.5

五、结果与讨论

（1）体外HPLC 分析方法 　按照色谱条件测定 ,峰面积(A)与浓度(C)的回归方程为A=13368C-293.99 , r =0.9998 ,在1. 0～50. 0μg/ mL浓度范围内 ,EPI 浓度与峰面积线性关系良好。0.1,1和 8μg/mL 3 个浓度的日内、日间精密度的 RSD均小于1.5 %,最低检测限为 50 ng/ mL。

（2）溶出曲线数学方程拟合

使用以下三个方程对缓释片的溶出曲线进行拟合。

Higuchi方程：M_t/ M_∞=K_Ht_1/2 （1）

零级模型公式：M_t / M_∞=K₀t （2）

一级方程：ln(1—M_t/M_∞)＝-Kt （3）

Mt / M_∞为在任何时间t 药物积累释放分数；K₀，K_H，K分别为（1），（2），（3）的速度释放常数。

（3）二次回归模型的建立

试验结果见表 2。利用Statistica 6.0软件对表2实验数据进行回归分析 ,得二次多元回归模型为:

Higuchi方程：Y=0.9968+0.002375*X₁ + 0.004988*X₂ +0.003338*X₃- 0.00435*X₁*X₁- 0.005325*X₁*X₂ - 0.001275*X₁*X₃ - 0.002975*X₂*X₂ - 0.002*X₂*X₃- 0.003525*X₃*X₃

一级方程：Y=0.927 - 0.002738*X₁ -0.000938*X₂ + 0.0012*X₃ +0.017687*X₁*X₁- 0.001425*X₁*X2 + 0.0069*X₁*X₃ + 0.017637*X₂*X₂ - 0.0105*X₂*X₃- 0.007238*X₃*X₃

零级方程：Y=0.9443 +0.022037*X₁ + 0.005087*X₂ -0.01525*X₃ - 0.0097*X₁*X₁-0.02075*X₁*X₂ - 0.013925*X₁*X₃ - 0.01285*X₂*X₂ + 0.011775*X₂*X₃+ 0.006725*X₃*X₃

表 2 Box-Behnken实验设计表及效应值

Tab 2Encapsulation eff iciency and EPI loading amount of formulations in Box-Behnkendesign (n = 6)

	X₁	X₂	X₃	Higuchi方程	一级方程	零级方程
1	-1	-1	0	0.9751	0.9542	0.8404
2	-1	1	0	0.9959	0.96	0.938
3	1	-1	0	0.9937	0.9675	0.947
4	1	1	0	0.9932	0.9676	0.9616
5	0	-1	-1	0.9821	0.927	0.984
6	0	-1	1	0.9887	0.9545	0.9281
7	0	1	-1	0.9959	0.9413	0.9247
8	0	1	1	0.9945	0.9268	0.9159
9	-1	0	-1	0.9815	0.9559	0.9302
10	1	0	-1	0.9856	0.9207	0.9811
11	-1	0	1	0.9948	0.9404	0.9294
12	1	0	1	0.9938	0.9328	0.9246
13	0	0	0	0.9993	0.9132	0.9386
14	0	0	0	0.9949	0.9341	0.9475
15	0	0	0	0.9962	0.9337	0.9468

（4）方差分析和显著性检验 　三个拟合的一元二次方程的相关系数分别为0.9508，0.8867和0.8144 ,说明溶出曲线拟合的Higuchi方程的相关系数R值为响应值（Y）的设计模型拟合程度良好,该模型是合适的,可以用此模型对TT凝胶缓释骨架片的处方进行分析和预测。从表3可知,实验观察值和模型预测值都比较接近,模型的预测性良好。从表4回归系数的显著性检验可知 ,模型(1)二次项 X₂与X₃ (P<0.05) 显著 ,X₁*X₂(P<0.05) 显著，其它不显著。

表3 Y1 和 Y2 的实验值、预测值及其偏差

Tab 3 The observed andpredicted values of response Y1 and Y2 and their residuals

	Observed	Predicted	Residuals
1	0.9751	0.976787	-0.00169
2	0.9959	0.997413	-0.00151
3	0.9937	0.992187	0.001513
4	0.9932	0.991513	0.001687
5	0.9821	0.979974	0.002126
6	0.9887	0.99065	-0.00195
7	0.9959	0.99395	0.00195
8	0.9945	0.996626	-0.00213
9	0.9815	0.981937	-0.00044
10	0.9856	0.989237	-0.00364
11	0.9948	0.991163	0.003637
12	0.9938	0.993363	0.000437
13	0.9993	0.9968	0.0025
14	0.9949	0.9968	-0.0019
15	0.9962	0.9968	-0.0006

表4回归方程系数的显着性检验

Tab4 Signif icance test of coeff icient in regression equation

Source	DF	SS	MS	F	Pr > F
X₁	1	0.000045	0.000045	3.526906	0.119182
X₂	1	0.000199	0.000199	15.55366	0.010918
X₃	1	0.000089	0.000089	6.964809	0.046026
X₁*X₁	1	0.00007	0.00007	5.46076	0.066643
X₁*X₂	1	0.000113	0.000113	8.864942	0.030892
X₁*X₃	1	6.50E-06	6.50E-06	0.508226	0.507787
X₂*X₂	1	0.000033	0.000033	2.554162	0.170897
X₂*X₃	1	0.000016	0.000016	1.250537	0.314279
X₃*X₃	1	0.000046	0.000046	3.585856	0.116814