主题:【资料】多重免疫荧光染色步骤和原理

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多重荧光免疫组化技术 (Multiplex immunohistochemicalmIHC) 也称作酪氨酸信号放大 (Tyramide dignal amplificationTSA) 技术,是一类利用辣根过氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。



这一技术基于酪胺信号的放大效应,实现对单个细胞或组织样本上多个目标靶点的同时检测。这为全面研究细胞组成、细胞功能以及细胞间的相互作用提供了强大的工具。通过多重荧光免疫组化技术,科学家们可以更深入地了解细胞的奥秘,揭示生命现象的复杂性。



mIHC 实验原理及流程




TSA 技术采用 HRP 标记的二抗,HRP 催化加入体系的 TSA 衍生荧光染料,生成活化荧光底物,活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合,将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体,再换下一种一抗来第二轮孵育,换另一种荧光素底物,如此往复就可实现多重标记。





原理:带有染料标记的底物酪胺 (T) 分子在过氧化氢氧化环境下,被抗体或探针固定的 HRP 转化为具有短暂活性的中间状态 (T*),然后被激活的中间态分子 (T*) 迅速与相接蛋白分子的富含电子区域 (酪氨酸残基) 进行稳定的共价结合,未被标记的酪胺分子将被洗脱,借此实现对抗原的特异性染色。由于相接的蛋白 (包括 HRP,抗体,目标抗原) 都含有大量的酪氨酸结合位点,所以目标抗原处会富集大量标记分子,使信号被有效放大 。



多重免疫荧光染色的步骤包括样品制备、抗原诱导、抗原解露等。具体如下:



①样品制备:根据细胞或组织的不同,选择不同的处理方式。对于细胞样品,需要固定和渗透化处理以保持其形状和蛋白质结构。对于组织样品,需要切片并进行染色前的去脂处理。

②抗原诱导:如果目标标记物是蛋白质,那么需要选择适当的抗体来识别目标蛋白质。抗体可以人工合成或从动物体内提取。

③抗原解露:对于细胞样品,可以利用活液解离细胞,并将细胞固定在载玻片上。





IHC mIHC区别与联系



免疫组化,是应用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对其进行定位、定性的研究。



简单来说,mIHC 属于 IHC 的升级版本!



Tips



相同点:



能够完整显现组织原位形态信息。



不同点:



1. 常规免疫组化的分析属于定性分析,其判断大多依赖于经验,其分析结果会有差异。而多重荧光免疫组化属于定量分析,其利用软件可对组织中的细胞进行精准的结果分析。



2. 常规免疫组化受传统染色成像的限制,靶标少于 3 个,无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现多因子共定位,可以获取更多的生物信息,且样本需求量较少。



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