主题：【分享】【金秋计划】琼脂糖凝胶电泳技术详细操作步骤和详解

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发表于：2024/09/06 21:55:38 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

一、琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳是一种重要的分子生物学研究方法，?它利用琼脂糖凝胶的网络结构，?通过电场作用使带电颗粒（?如DNA或RNA）?在凝胶中移动，?根据分子大小和电荷性质的不同实现分离。?这种技术不仅操作简单迅速，?而且具有高分辨率，?因此在基因操作中扮演着关键角色，其原理主要基于DNA分子的两大特性：电荷效应和分子筛效应。

?琼脂糖是一种天然的长链状聚合分子，它在沸水中溶解，当温度降至45℃时开始凝固并形成多孔刚性立体网状结构，其孔径的大小取决于琼脂糖的浓度。

分子筛效应指的是琼脂糖凝胶由琼脂糖分子交联形成的网状结构，其孔径大小与琼脂糖浓度成反比。当DNA分子通过凝胶时，会受到凝胶孔径的阻碍。较小的DNA片段可以通过凝胶孔隙，而较大的DNA片段则会被阻挡，导致迁移速率降低。??

电荷效应指的是DNA分子在碱性条件下（pH>7）会电离，带负电荷。当DNA样品置于电场中时，在外加电场的作用下受到电场力的作用，向正极方向移动。DNA分子的迁移速率与其所带的电荷量成正比，而电荷量又与DNA片段的长度成正比。因此，在相同电场条件下，较长的DNA片段迁移速率较慢，而较短的DNA片段迁移速率较快。不同DNA的分子量大小及构型各不相同，因此它们在电泳中的迁移率也会有所不同，从而可分离出不同的区带。为什么核酸条带显示荧光？主要便于观察，对核酸进行了染色。溴化乙锭EB是一种扁平状分子，在紫外光照射下能发射荧光。当EB与DNA分子形成EB-DNA复合物后，其发射的荧光强度比游离状态的EB提高10倍以上，且荧光强度与DNA的含量呈正比。

二、?琼脂糖凝胶电泳的详细操作步骤（1%琼脂糖凝胶电泳为例）

1.安装制胶模具：利用电泳托盘，安装制胶模具，水平放置于试验桌上。
2.制备琼脂糖凝胶：将琼脂糖粉末溶解于缓冲液中，加热煮沸，冷却后凝固成凝胶。（根据电泳所需要的分辨率准备琼脂糖-电泳缓冲液凝胶溶液）(1)称取1g琼脂糖，放入盛有100mL 0.5×TBE缓冲液的500mL三角瓶中，摇匀用天平称量其重量，摇匀。在微波炉中，使琼脂糖完全溶解，放回天平上，加入蒸馏水补齐至初始重量。冷却至不烫手(55℃左右)，加入100μL0.5mg/mL EB溶液(终浓度为0.5 μg/mL)，或加入5-10μLStarGreen DNA Dye(GenStar)，摇匀。

(2) 将凝胶溶液倒入安装好的制胶模具中，凝胶厚度应在3-5mm。

(3) 选择合适的梳子，梳子的插入深度应使齿的底部和板的表面距离在0.5到1.0mm。要检查梳子齿下方或之间是否有气泡，在室温下冷却凝固。

(4) 待凝胶充分凝固后，垂直向上小心拔出梳子，以保证点样孔完好。

(5)将凝胶置入电泳槽中，加入0.5×TBE缓冲液，以浸没凝胶约1mm为合适。

3.制备DNA样品：将DNA样品与上样缓冲液混合。

把DNA样品和上样缓冲液混合，利用移液枪把电泳样品加到没入缓冲液中凝胶槽中，在凝胶的两侧样品槽内加入合适的分子量标准品。

上样量的多少根据样品中DNA片断的多少和大小而定，已知浓度的DNA用于估测样品质粒DNA的浓度。
4.电泳：将DNA样品加载到凝胶上的样品孔中，在电场的作用下进行电泳。

盖上电泳槽的盖子，正确连结电泳槽上的导线。电泳电压以正负电极的距离的一到五倍为合适（1到5V/cm）。如果电泳线连接正确，那么在进行电泳时可以看到有气泡从电泳槽内电极导线处产生，同时，在几分钟后，可见溴酚蓝条带从负极向正极移动，从上样槽内移入胶体。

5.观察：当核酸样品移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。电泳结束后，利用紫外灯观察DNA片段的迁移情况。当DNA样品在凝胶内移动到合适的距离时，关闭电源，去除电泳导线和电泳槽盖子。在室温下，用电泳缓冲液或水配制的EB溶液(0.5 μg/ml)对凝胶进行染色。

三、琼脂糖凝胶电泳的主要应用

1.DNA片段的鉴定：通过比较DNA片段的迁移距离，与标准品进行对照，可以判断DNA片段的大小。

2.DNA片段的分离：利用不同大小DNA片段的迁移速率差异，可以将DNA片段进行分离。

3.DNA的纯化：通过电泳将目的DNA片段与其他杂质分离，得到纯化的DNA片段。（割胶回收）

四、操作技巧和注意事项

1.EB毒性

EB是一种很强的诱变剂。在接触含有EB溶液时，应该全程戴手套和口罩。

电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。

2. 加热熔化琼脂糖

用微波炉加热熔化琼脂糖时，溶液体积不能超过三角瓶容量的1/3，以免煮沸时溶液溢出。同时，琼脂糖必须完全熔化，否则可能导致电泳图像模糊不清。

3.凝胶厚度

凝胶的厚度一般为4-6nm，若太厚可能会影响检测的灵敏度。待凝胶充分凝固后才能拔出梳子，以保证点样孔形状完好，防止漏样。4.上样

上样时，须先除去点样孔中的气泡，并且加样操作需小心谨慎，以免漏样或损坏胶孔。

5.电泳电压

选择适当的电泳运行条件很重要，包括电压和距离。推荐的电压范围是4-6V/cm，电压太低会降低迁移率，电压太高会降低分辨率。

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