本文研究了苯酚-硫酸法检测不同基质的保健品中粗多糖的含量，论述了不同基质的前处理方法和经验。
1 前言
市场上常见的保健品多种多样，胶囊、口服液、药片等等。多糖含量作为保健品中的有效成分之一，越来越引起人们的关注。从药理学上讲，多糖具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、抗氧化、抗心血管疾病等。因为具有诸多功效，许多保健品生产公司也开发越来越多的含多糖保健品，通过在保健品中添加含有多糖的中药材或者海洋生物，从而使该保健品具有较高的多糖含量，增强其功效。不仅在胶囊、口服液等常规的保健品中添加含有多糖的成分，甚至在一些咖啡、饮料、食品中也添加含有多糖的组分，使其成为功能性的产品。
多糖的含量对其功效的发挥至关重要，那么怎么准确、有效地检测出保健品中多糖的含量是一个重要的环节。保健品由于种类繁多，基质复杂，找到一种简单、有效的检测方法，能够检测出各种基质的保健品中多糖的含量具有重要的意义。
本实验中采用了常见的苯酚-硫酸法检测保健品中粗多糖含量，选用乙醇提取以除去单糖、低聚糖、甙类及生物碱等干扰成分，然后用去离子水提取其中所含的多糖类成分。多糖在硫酸作用下，水解成单糖，并迅速生成糖醛衍生物与苯酚综合成有色化合物，用分光光度法测定其多糖含量。
2 实验部分
2.1 试剂
95%乙醇;
葡萄糖：优级纯；
葡萄糖标准液：精确称取105℃干燥恒重的葡萄糖100 mg,置100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶液解并稀释至刻度（可加几滴甲苯或几粒苯甲酸防腐）。此标准溶液1.00 ml含葡萄糖1.00 mg，储存于冰箱冷藏；
苯酚；
苯酚液：称取优级纯苯酚10.0 g,加水150 g ,置棕色瓶中备用，储存于冰箱；
浓硫酸。
2.2 仪器
分光光度计。
2.3 分析步骤
2.3.1 样品预处理
（1）口服液等液体样品
准确移取2.00～10.00 mL液体口服液试样,置于250 mL圆底烧瓶中，加入9倍体积的95%乙醇,混匀，静置1 h，回流提取1 h,趁热过滤,残渣用95%乙醇5 ml洗涤三次。将残渣连同滤纸置于烧瓶中，加蒸馏水50 mL，在60℃水浴中加热提取30 min,趁热过滤，残渣用5 mL热水洗涤三次，洗液并入滤液，放冷后移至100 mL容量瓶中，稀释至刻度，备用。
（2）内容物为膏状的胶囊样品或者膏状类样品
准确称取0.50～1.00 g膏状内容物或膏状样品,倘若其中含有油脂类辅料，加入乙醚或者石油醚脱脂，离心，弃去乙醚或者石油醚层。再用一定体积的水溶解，转移至250 mL圆底烧瓶中，加入9倍体积的95%乙醇,混匀，静置1 h，回流提取1 h,趁热过滤,残渣用95%乙醇5 ml洗涤三次。将残渣连同滤纸置于烧瓶中，加蒸馏水50 mL，在60℃水浴中加热提取30 min,趁热过滤，残渣用5 mL热水洗涤三次，洗液并入滤液，放冷后移至100 mL容量瓶中，稀释至刻度，备用。
（3）内容物为粉状的胶囊样品或者粉状片剂、咖啡等
准确称取0.10～0.50 g均质后的粉状样品,倘若其中含有脂肪类辅料，先加入一定体积的水，溶解粉状样品，再加入乙醚或者石油醚脱脂，离心，弃去乙醚或者石油醚层。将水层转移至250 mL圆底烧瓶中，加入9倍体积的95%乙醇,混匀，静置1 h，回流提取1 h,趁热过滤,残渣用95%乙醇5 ml洗涤三次。将残渣连同滤纸置于烧瓶中，加蒸馏水50 mL，在60℃水浴中加热提取30 min,趁热过滤，残渣用5 mL热水洗涤三次，洗液并入滤液，放冷后移至100 mL容量瓶中，稀释至刻度，备用。
2.3.2 标准曲线的制备
吸取葡萄糖标准液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加水定容。吸取上述溶液各2.00 mL,再加苯酚液1.00 mL,涡旋混合均匀,迅速沿管壁加入浓硫酸5.00 mL,摇晃后涡旋混合，放置5 min,置沸水浴中加热15 min,取出后冷却至室温,于490 nm处以水代替样品作参比测吸光度,绘制标准曲线。
2.3.3 样品中多糖含量测定
吸取2.00 mL样品液，置于10 ml容量瓶中,加水定容。吸取2.00 mL上述溶液，按标准曲线制备项下方法测定吸光度。另以2.00 mL水，同上操作做空白。查标准曲线得样品液中葡萄糖含量。
2.3.4 液体样品分析结果的计算
计算液体样品中酸性多糖的含量按式(1)或者（2）计算,分别以mg/mL或者mg/g表示。
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式中:
X—保健品中酸性多糖含量(以葡萄糖计), mg/g或者mg/mL表示；
A—从浓度-吸光度曲线上查得样品溶液的葡萄糖浓度，μg；
B—从浓度-吸光度曲线上查得空白溶液的葡萄糖浓度，μg；
V₁—多糖溶液总体积，mL，如按本方法为100 mL；
V₂—移取多糖溶液的初始体积，mL，如按本方法为2 mL;
V₃—待测多糖浓度溶液的总体积，mL，如按本方法为10 mL；
V₄—待测多糖溶液的移取体积，mL，如按本方法为2 mL;
m—保健品的称取质量，g；
V₀—保健品的测试体积，mL；
如两次测定符合允许差时，取两次测定结果的算术平均值作为结果，报告结果取三位有效数字。
2.3.5 允许差
同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10％。
2.3.6 结果与分析
（1）含油脂类样品脱脂与否的影响
含有油脂类的保健品，脱脂前后采用上述方法进行酸性多糖含量测定时，多糖含量有一定的差别，未脱脂的样品进行多糖含量测定时，过滤过程十分缓慢，耗时长，多糖含量数据经常不平行，而且数值偏高。

图1 乙醚脱脂

样品经过乙醚脱脂后有明显的油脂层。

图2 回流后的未脱脂样品

图3 回流后的脱脂样品

通过比较图2和图3，脱脂后的样品溶液更加澄清，无论是过滤还是洗涤，反应更快速，洗涤效果也更好。相反，未脱脂的样品，整个容器壁上都黏附着脂肪、油脂层，即使离心后过滤，过滤速率也很差，滤液也很浑浊，如下图4所示。

图4 脱脂前后滤液的比较

没有脱脂的样品，油脂层包裹着含有单糖或者寡糖的乙醇溶液，不容易被乙醇洗涤干净，这部分残留的单糖或者寡糖导致结果偏高。因此，对相应的含油脂保健品提前进行脱脂后再检测多糖，不仅能减少操作的时间，还能获得更为准确的结果。

（2）醇沉时间的影响

对以含有大豆油辅料的胶囊内容物进行脱脂后沉淀粗多糖，对比了加入9倍95%乙醇后立即回流提取多糖和加入9倍95%乙醇后室温下静置1 h再回流提取多糖，结果显示，加入乙醇后立即回流提取多糖与静置1h后再回流检测出的多糖含量分别为41.69 mg/g、48.08mg/g。可以看出，室温下醇沉时间的增加可以使更多的粗多糖醇沉完全，检测含量增高。

（3）苯酚硫酸法操作方法的影响

苯酚硫酸法检测粗多糖含量最为常见，操作简单，适用于常规检测。在实验过程中发现，无论苯酚和浓硫酸的加入比例是1:5还是1:10，苯酚的体积分数是5%还是6%，在进行加入时最好是一个样品加完苯酚，混匀后，立即沿管壁加入浓硫酸，混匀后，再加另一个样品的苯酚和浓硫酸，这样显色更稳定。实验中发现，倘若对所有样品全加完苯酚混匀后，再统一加浓硫酸，显色及不稳定，标准曲线甚至不成线性。苯酚易挥发，长时间与空气接触也容易被氧化，造成结果不稳定。