主题：【第十二届原创】方便面中有机磷酸酯的赋存及人体暴露风险

方便面中有机磷酸酯的赋存及人体暴露风险

摘要：有机磷酸酯（Organophosphate esters, OPEs）在全球环境中被广泛检出，近年来受到了环境科学家的关注。目前已有一些关于食品中OPEs污染的研究，表明食品可能被其污染并成为人类暴露的重要来源。然而，作为深受消费者喜爱的快消食品方便面中的有机磷酸酯赋存研究极为缺乏。本研究对采集于中国北京市8种市售方便面（TY, KSF, NJC, JML, NX, XHX, CDK, HF）中12种OPEs的残留水平进行了分析。12种OPEs单体中，有8种单体在方便面中检出，∑8OPEs 浓度范围为1.28-99.3ng/g dw。TY中总OPEs残留水平最高。成人和青少年通过摄入方便面所致∑8OPEs的每日预计摄入量分别为2.67和7.53 ng/kg bw/day。TY是不同方便面中总OPEs暴露量的主要贡献者。初步暴露评估表明，目前通过方便面摄入的OPEs所致的慢性疾病危险商数在10-6-10-3范围内，处于低风险水平。此外，OPEs的危险指数表明，青少年（3.04×10-3）的风险高于成人（1.08×10-3）。
关键词：有机磷酸酯；方便面；每日预计摄入量；危险商数；危害指数

有机磷酸酯（OPEs）是一组人工合成的磷酸衍生物，其作为阻燃剂、增塑剂、消泡剂、液压油、油漆和地板抛光剂等中的添加剂已使用了几十年。近年来，传统型溴代阻燃剂多溴二苯醚和六溴环十二烷因为具有持久性、生物富集性和生物毒性而相继禁用，OPEs的产量和使用量逐年增加。OPEs作为添加剂掺合到使用的材料中，其与材料之间没有稳定的化学键合作用，因此会通过磨损、泄露和挥发等方式缓慢的释放到周边环境中。目前，OPEs在空气、灰尘、水和沉积物等环境介质，水生动物，陆生动物甚至是人体血液、母乳和尿液中均有检出，表明OPEs的污染已经无处不在。
许多毒理学研究表明OPEs，如三（2-正丁氧乙基）磷酸酯（Tris(2-butoxyethyl) phosphate,TBEP），三（1-氯-2丙基）磷酸酯（Tris(2-chloroisopropyl) phosphate，TCPP），三（1,3-二氯-2丙基）磷酸酯（Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate，TDCPP），三乙基磷酸酯（TEP）和三甲苯基磷酸酯（Tri-cresyl Phosphate， TCrP）对鱼类，鸟类，啮齿动物和人类的胚胎发育，mRNA表达，甲状腺激素分泌，循环胆汁酸分泌以及神经系统具有毒副作用。此外，三（2-氯乙基）磷酸酯（Tris(2-chloroethyl) phosphate，TCEP）、TCPP、TDCPP、TBEP、三正丁基磷酸酯（Tributyl phosphate， TNBP）、三苯基磷酸酯（Triphenyl phosphate, TPHP）具有潜在的致癌性。因此，了解OPEs的人体暴露水平对于制定策略用以管控其潜在危害十分重要。
空气吸入，皮肤接触灰尘和饮食摄入是OPEs暴露于人体的主要途径。 目前，已有一些研究报道了皮肤接触灰尘和吸入是OPEs暴露于人体的两个重要途径，然而OPEs的膳食暴露研究却十分有限。食品在生产、储存和加工期间可能被环境中无处不在的OPEs和存在于涉及食品加工的若干材料中的OPEs污染，从而成为人类暴露的重要来源。方便面是深受消费者喜爱的快消食品。我国作为方便面的生产及消费大国，2015年总消费量为404.3亿份，占全球41.4%，远高于其他国家。然而，关于方便面中有机磷酸酯的残留水平及暴露风险的研究仍未见报道。本研究对采集于北京市8种市售方便面（TY, KSF, NJC, JML, NX, XHX, CDK, HF）中12种OPEs的残留水平进行了分析，对OPEs的暴露水平和风险进行了评估。该结果可以初步了解居民通过方便面摄入OPEs的暴露状况。

1  实验部分
1.1  仪器、试剂与材料
高效液相色谱仪（Ultimate 3000, 美国Thermo公司），三重四级杆质谱仪（TSQ Quantiva, 美国Thermo公司），高速离心机（美国Sigma-Aldrich公司），低速离心机，氮吹浓缩仪（REACTI-THERM III#TS-18824, 美国Thermo公司），分析天平（CP224S, 德国Sartorius公司）。
LC-MS级别溶剂甲醇和乙腈均购自于美国Fisher Scientific。HPLC级甲酸（Formic acid）购自中国DiKMA公司。分散固相萃取填料氨丙基硅胶（PSA）和十八烷基硅烷（C18）均购自美国Sigma-Aldrich公司。无水MgSO4和NaCl分别购自美国Sigma-Aldrich公司和中国医药集团有限公司，二者使用前置于马弗炉中450℃烘烤8h以去除可能残留的有机物。
OPEs标准品，三甲基磷酸酯（Trimethyl phosphate, TMP, 纯度95%）和三异丁基磷酸酯（Triisobutyl phosphate, TiBP, 纯度95%）分别购自美国AccuStandard公司和中国J&K Scientific公司。 纯度为98%的标准品TEP、TCEP、TCPP、TPHP、TDCPP和TNBP均购自美国Cambridge Isotope Laboratories。TBEP、TCrP、2-乙基己基二苯基磷酸酯（2-Ethylhexyl diphenyl phosphate, EHDPP）和磷酸三辛酯（Tris(2-ethylhexyl) phosphate, TEHP）标准品纯度大于98%，均购自于美国Wellington Laboratories。OPEs同位素标准品，包括TEP-d15、TCEP-d12、TCPP-d18、TDCPP-d18、TPHP-d15和TNBP-d27 均购自于美国Cambridge Isotope Laboratories。TEHP-d51（纯度100%）购自于加拿大Toronto Research Chemicals公司。

1.2  样品及前处理
8种不同品牌的方便面样品采集自北京市区超市。使用粉碎机将面饼充分粉碎后，准确称取1g样品加入到15mL Corning离心管中，然后加入7种氘代OPE作为内标（1ng）并老化过夜。之后，加入5 mL含0.5%甲酸的乙腈溶液并涡旋1-2min至其完全混合。使用超声萃取10min，之后在4000 r/min下离心并收集上清液。提取步骤以上述相同步骤重复两次，并将提取溶液合并。合并提取液使用高纯氮气在柔和气流下浓缩至2mL。然后加入400 mg MgSO4和100 mg NaCl并涡旋1min，在4000 r/min下离心5min。将上清液小心转移至干净的Corning 离心管中，加入300 mg MgSO4和100 mg PSA以进一步去除杂质。同上，涡旋、离心、收集上清液。然后用高纯氮气以柔和气流下吹干，然后复溶至1 mL甲醇，保存于冰箱中（4℃）。进样前，在12000 r/min下离心5min，取上清液上机分析，进样量为10μL。

1.3  仪器分析
OPEs的分析使用HPLC-MS/MS系统。液相分离色谱柱为SunFire C18柱（4.6mm×150mm×3.5μm, Waters），柱温为40℃。采用二元流动相（A：超纯水，B：甲醇，二者均含0.1%的甲酸）进行梯度洗脱，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0min （10%B），2min （10%B），5.5min （65%B），9.5min（80%B），11.5min（100%B），15min（100%B），16min（10%B），20min（10%B）。OPEs的保留时间见表1。
三重四级杆质谱使用电喷雾离子源并以正离子模式运行。电喷雾电压为3.5千伏，喷雾锥和离子传输管温度均为350℃。氩气和氮气分别充当碰撞气和脱溶剂气。质谱数据采集模式为选择反应离子监测（selected reaction monitoring, SRM），每种OPEs分析物的SRM参数，包括定量/定性离子对、碰撞能等列于表1。

1.4  质量控制
每批实际样品处理中均加入程序空白，以监测实验过程中可能存在的污染，详细数据列于表1。对于程序空白中检出的OPEs单体，以其平均浓度加上3倍标准偏差计算化合物的方法检出限（MDL）。对于程序空白中未检出的OPEs单体，以仪器检出限（IDL，3倍信噪比计算而得）代替方法检出限。本文中OPEs的方法检出限范围为：0.002-0.19ng/g，详细数据见表1。
本文使用7种OPEs氘代同位素标准品作为内标，配制了内标标准曲线，线性范围为：0.1-100ng/mL，0.998<R2<0.9996。在方便面样品前处理之前，对待分析的目标化合物加标回收率进行了优化，最终加标回收率控制在81.3%-107%，相对标准偏差（RSD）小于10%，详细数据见表1。

1.5  OPEs的人体每日预计摄入量和暴露风险
OPEs的人体每日预计摄入量（Estimated daily intakes, EDIs）由公式Ⅰ计算：

EDIs= ∑DCi*CCi/ BW  （ng/kg bw/day）    （Ⅰ）

其中， DCi是方便面的每日摄入量（g/d）：青少年(6-17岁)为21.7 g/d，成年人（≥18岁）为11.9 g/d；CCi是食物中每种污染物的平均浓度（ng/g）；BW是体重：成人平均为65kg，青少年平均为42kg。
OPEs暴露于人体所致危险商数（Hazard quotient, HQ）、危险指数（Hazard index）分别由公式Ⅱ和公式Ⅲ计算：

HQ= EDIs/RfD values      （Ⅱ）

HI=∑HQ    （Ⅲ）

其中， RfD values为参考剂量值，单位为ng/kg bw/day：通过将慢性疾病最大无作用剂量除以因子10000来计算RfD。当HQ或HI值≥1时，认为OPEs对人体具有较高的健康风险。

2  结果讨论
2.1  方便面中OPEs的浓度水平与单体组成
程序空白中OPEs残留水平见表1。TBEP、TIBP、TNBP在程序空白中背景污染浓度较高，其平均浓度分别为0.11、0.08 、0.07 ng/g，高于样品中对应的三种OPEs浓度均值，故在本文中不予讨论。TEHP在程序空白和实际样品中均未检出，其他8种OPEs在程序空白中背景污染浓度较低，其平均浓度范围为0-0.06 ng/g，低于样品中对应的OPEs浓度均值的15%（见图1；表1和2）。
方便面中8种OPEs总浓度（∑₈OPEs）范围为1.28-99.3ng/g dw（dry weight,干重浓度），平均浓度为14.6 ng/g dw，与张等报道的中国谷类（8.08 ng/g dw）、水果（9.74 ng/g dw）及蔬菜（19.4 ng/g dw）中∑₆OPEs平均浓度相当。方便面中∑₈OPEs平均浓度低于中国大米中的平均浓度为（69.9 ng/g dw），但高于中国肉类中∑₆OPEs平均浓度（4.13 ng/g dw）。此外，郭等分析了中国15种品牌奶粉中9种OPEs残留水平，仅TEP在奶粉中被检出，其平均浓度为 0.4 ng/g dw，远低于本研究中方便面中的浓度（14.6 ng/g dw）。上述比较表明方便面是OPEs通过膳食暴露于我国人体的一种重要食品材料。
不同方便面中∑₈OPEs浓度、每种OPEs单体浓度和OPEs单体组成分别见图2和图3。∑₈OPEs浓度最高的是TY（99.3 ng/g dw），远高于其他7种方便面中∑₈OPEs浓度（1.28-5.39 ng/g dw），其次是KSF，浓度为5.39 ng/g dw。TY和KSF中均以TCEP为主要OPE单体，其浓度分别为∑₈OPEs总浓度的87.9%和81.1%。其他方便面中∑₈OPEs浓度大小顺序为：NJC（2.87 ng/g dw）> JML（2.59 ng/g dw）> CDK（2.31 ng/g dw）> XHX（1.43 ng/g dw）> NX（1.39 ng/g dw）> HF（1.28 ng/g dw）。JML、XHX、NX和HF中均以TEP和TCPP为主要单体，二者对于∑8OPEs的贡献率范围为67.6%-86.7%（77.9%，均值）。NJC中主要的OPE单体为TCrP、TPHP、TCPP和TDCPP，总贡献为89.4%，而CDK中主要的OPE单体为EHDPP、TCEP和TCPP，总贡献为73.6%。不同方便面中OPEs浓度和单体组成差异性可能与其使用的原材料、生产工艺以及包装材料差异有关。尽管不同方便面中每种OPE单体对于∑8OPEs的相对贡献率不同，但8种方便面总体上以TEP, TCEP和TCPP为主要单体，其贡献总和为78.4%（见图3），表明这三种OPE单体在方便面的生产加工或者包装中有相似的来源。

2.2  OPEs暴露量及其风险评估

表2给出了成人和青少年的OPEs膳食摄入量。成人总OPEs的平均EDIs值为2.67 ng/kg bw/day，低于青少年总OPEs的平均EDIs值（7.53 ng/kg bw/day）。TCEP和TEP是OPEs中暴露剂量最高的两种单体，二者暴露剂量之和约占总OPEs暴露剂量的93％。成人TCEP和TEP的平均EDIs值分别为2.13和0.35 ng/kg bw/day，低于青少年中TCEP和TEP的平均EDIs值（6.01和0.99）。
方便面中赋存的OPEs通过膳食暴露于人体可能对健康产生危害，因此对每种OPEs单体暴露风险（HQ）及∑₈OPEs的暴露风险（HI）进行了评估，结果见表2。成人因方便面膳食摄入所致∑₈OPEs的暴露风险（HI）值为1.08×10^-3小于儿童HI 值3.04×10^-3，二者因膳食方便面暴露于OPEs所致的暴露风险较低（HI<1）。就每种OPEs单体而言，成人和儿童因方便面膳食摄入所致TCEP的暴露风险（HQ）值最高，分别为9.68×10^-4和2.73×10^-3。值得注意的是，本文仅评估了居民通过摄入方便面暴露于OPEs的健康风险，没有进行广泛的食品调查，因此居民通过饮食摄入暴露于OPEs的健康风险可能被低估；并且儿童和青少年作为易感人群，在未来OPEs的膳食暴露研究中更值得关注。

3  结语
在本研究中，12种OPEs单体中有8种单体在方便面中检出，∑8OPEs 浓度范围为1.28-99.3ng/g dw。TY中总OPEs残留水平最高。本研究的结果表明，通过摄入方便面是OPEs暴露于我国人体的一种重要途径；青少年作为易感人群，可能具有更高的暴露风险。此外，某些品牌中OPEs含量较高，为降低因长期摄入该品牌方便面带来的潜在健康风险，建议经常更换品牌进行消费。

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