摘要:对灭菌乳中乳果糖含量进行研究,初步探索了用紫外分光光度法对其进行测定的方法.牛奶在加热处理过程中, 部分乳糖异构为乳果糖, 经β-D- 半乳糖苷酶水解后生成半乳糖和果糖,通过酶转化为NADPH,确定其最大吸收波长为340nm,可在此波长下测出它的吸光度并计算出其质量浓度.结果表明:该方法灵敏度高,准确性好,适用于灭菌乳中乳果糖含量的测定。

关键词：紫外分光光度灭菌乳乳果糖

国务院办公厅《关于加强液态奶生产经营管理的通知》要求，完善液态奶标准并严格按标准组织生产，凡在灭菌乳、酸牛乳等产品生产加工过程中使用复原乳的，不论数量多少，生产企业必须在其产品包装上醒目标注“复原乳”。农业部近发布的《巴氏杀菌乳和ＵＨＴ灭菌乳中复原乳的鉴定》标准，为巴氏杀菌乳和ＵＨＴ灭菌乳中复原灭菌乳中复原乳的乳成分的检测提供了科学依据。

本实验采用紫外分光光度法对灭菌乳中乳果糖含量进行测定，并优化了试验方法，采用光谱扫描功能对最大吸收波长进行优化，并采用时间扫描功能监控酶的反应速率。确定在紫外光区340nm处测定乳果糖的方法，该方法灵敏度高，准确性好，对乳品中复原乳的监控起到积极作用。

1仪器和试剂

1.1 仪器和设备

1.1.1 UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津有限公司）

1.1.2 水浴或干燥箱: 温度能维持在40℃±2℃。

1.2 试剂

除非另有说明, 在分析中仅用分析纯试剂和GB/T 6682- 1992中一级水。

碳酸氢钠(NaHCO₃)；过氧化氢(H₂O₂) , 质量分数为30%；辛醇(C₈H₁₈O)；灭菌水；300g.L^-1硫酸锌溶液；150 g.L^-1亚铁氰化钾溶液；0.33mol.L^-1氢氧化钠溶液；1mol.L^-1氢氧化钠溶液；缓冲液A: pH= 7.5称4.8 g 磷酸氢二钠, 0.86 g 磷酸二氢钠和0.1 g 硫酸镁溶解于80mL水中, 用1mol.L^-1 氢氧化钠溶液调整pH 到7.5±0.1 ( 20℃) , 稀释到100mL , 摇匀；缓冲液B: pH= 7.6称取14.00g三乙醇胺和0.25g硫酸镁溶解于80mL水中。用1 mol.L^-1氢氧化钠溶液调整pH到7.6±0.1( 20℃),稀释到100mL ,摇匀；缓冲液C将40.0mL缓冲液B 用水稀释到100mL ,摇匀；β-D- 半乳糖苷酶悬浮液用3.2 mol.L^-1 硫酸铵溶液将活性为30 IU.mg^-1 的β-D- 半乳糖苷酶制备成浓度为5mg.mL^-1的悬浮液；葡萄糖氧化酶悬浮液；用灭菌水将活性为200 IU•mg^-1 的葡萄糖氧化酶制备成浓度为20 mg.mL^-1悬浮溶液；过氧化氢酶悬浮液：用灭菌水将活性为65000 IU.mg^-1的过氧化氢酶制备成浓度为20 mg.mL^-1的悬浮液；己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液(混酶)：在1mL浓度为3.2 mol. L^-1硫酸铵溶液中加入2 mg 活性为140 IU.mg^-1 的己糖激酶和1 mg 活性为140 IU.mg^-1的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,轻摇均匀,成悬浮液；磷酸葡萄糖异构酶悬浮液

用3.2 mol. L^-1硫酸铵溶液将活性为350 IU.mg^-1的磷酸葡萄糖异构酶制备成浓度为2 mg.mL^-1 的悬浮液； ATP 溶液将50 mg 5'-ATP-Na2 和50 mg 碳酸氢钠溶于1mL水中；NADP 溶液：将10mgβ-NADP-Na₂溶于1mL水中。

2 试验方法

2.1 试液制备

量取50.0mL样品到100mL容量瓶中, 用水稀释到刻度后混匀。

2.2 纯化

吸取10.0mL试液于50mL锥形瓶中, 依次加入1.75mL亚铁氰化钾溶液、1.75mL硫酸锌溶液和6.5mL缓冲液A。每加入一种溶液后, 充分振荡均匀。全部溶液加完后, 静置10 min，过滤, 弃去最初的1mL～2mL滤液，收集滤液。

2.3 水解乳糖和乳果糖

吸取5.00mL滤液于10mL容量瓶中, 加入50μL的β-D-半乳糖苷酶悬浮液, 混匀后加盖。在40℃水浴或干燥箱培养至少10 h。

2.4 葡萄糖氧化

依次加入2.0mL 缓冲液C、100μL葡萄糖氧化酶悬浮液、1 滴辛醇、0.5mL 浓度为0.33mol.L ^-1氢氧化钠溶液、50 μL 过氧化氢和0.1 mL 过氧化氢酶悬浮液, 每加入一种试剂均要摇匀。全部溶液加完后, 在40℃水浴或干燥箱中培养3 h。冷却后稀释至10mL , 过滤, 弃去最初的1mL～2mL滤液, 收集滤液。

2.5 空白

依照2.1到2.4步骤处理空白溶液, 但不加β-D-半乳糖苷酶悬浮液。

2.6 测定

在石英比色皿中依次加入1.00mL缓冲液B,0.100mLATP溶液,0.100mLNADP溶液,1mL滤液和1mL水, 每加入一种试剂均要摇匀.混合均匀后，静置3min.加入20μL混酶.混合均匀后上机,并同时做试剂空白.

反应过程大约10min,每隔1min记录一次吸光度的变化,等两次吸光度不再变化,反应停止。此过程中吸光度的变化见表1

等反应到达终点后,记录下吸光度。加入20μL磷酸葡萄糖异构酶悬浮液,混合均匀后上机。

反应过程大约15min,每隔1min记录一次吸光度的变化,等两次吸光度不再变化,反应停止.此过程中吸光度的变化见表2.

2.7结果计算

2.7.1吸光值差

样品吸光值差△A_s的计算:△A_s = A_s2-A_s1

空白吸光值差△Ab的计算:△Ab= Ab2- Ab1

样品净吸光值差△AL的计算:△AL=△A s-△A b

2.7.2乳果糖含量

乳果糖的含量以样品的质量浓度c 计, 数值以

毫克每升(mg/L) 表示, 按下列公式计算:

式中:

△AL-样品净吸光值差；ML-乳果糖的摩尔质量( 342.3 g/mol)；ε-NADPH 在340 nm 处的摩尔吸光值( 6.3 L.mmol^-1.cm^-1) ；V₁-比色皿液体总体积, V₁=3.240mL ；V₂-比色皿中滤液的体积, V₂=1.00mL；d -比色皿光通路长度, d = 1.00cm；V-测试样体积( L) 。

计算结果精确到小数点后一位。

3 结果与讨论

3.1最大吸收波长的选择

在光谱模式下，测定标准系列的光谱图，仪器条件见表3。