主题：【华山论剑第十集】液质基础知识大普及

在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。
    柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。
    通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。
    每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。
四、检测器
    检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1．分类
1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。
2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。
3）按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。
4）检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。
2．性能指标
1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相流失）的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。
2）灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为mV•ml/g。对质量型检测器，它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为mV•s/g。
3）检测限(detection limit)
    检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。
    检测限指恰好产生可辨别的信号（通常用2倍或3倍噪音表示）时进入检测器的某组分的量（对浓度型检测器指在流动相中的浓度——注意与分析方法检测限的区别，单位g/ml或mg/ml；对质量型检测器指的是单位时间内进入检测器的量，单位g/s或mg/s）。又称为敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N为噪声，S为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限的大小。
    检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。值得注意的是，分析方法的检测限除了与检测器的噪声和灵敏度有关外，还与色谱条件、色谱柱和泵的稳定性及各种柱外因素引起的峰展宽有关。4）线性范围(linear range)：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。也可用响应信号的最大与最小的范围表示，例如Waters 996 PDA检测器的线性范围是-0.1~2.0A。定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。输出信号与样品量最好呈线性关系，这样进行定量测定时既准确又方便。但实际上没有一台检测器能在任何范围内呈线性响应。通常A＝BCx，B为响应因子，当x=1时，为线性响应。对大多数检测器来说，x只在一定范围内才接近于1，实际上通常只要x=0.98~1.02就认为它是呈线性的。

线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些，能同时测定主成分和痕量成分。此外还要求池体积小，受温度和流速的影响小，能适合梯度洗脱检测等。
几种检测器的主要性能：
    UV            荧光      安培      质谱      蒸发光散射
    信号        吸光度    荧光强度  电流      离子流强度      散射光强
    噪音        10-5      10-3      10-9           
    线性范围      105      104      105            宽     
    选择性        是        是        是            否      否
    流速影响      无        无        有            无     
    温度影响      小        小        大            小
    检测限(g/ml)  10-10      10-13      10-13      ＜10-9g/s      10-9
    池体积(µl)      2~10      ~7      ＜1      ——      ——
    梯度洗脱      适宜      适宜      不宜          适宜      适宜
    细管径柱      难        难        适宜          适宜      适宜
    样品破坏      无        无        无            有      无
5）池体积：除制备色谱外，大多数HPLC检测器的池体积都小于10µl。在使用细管径柱时，池体积应减少到1~2µl甚至更低，不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严重。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和灵敏度。
3．紫外检测器(ultraviolet detector)
    UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。如果溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度（实际是提高检测限）。此外，梯度洗脱时，还会产生漂移。
注：将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1时的波长称为溶剂的截止波长。也称极限波长。
    中国药典对UV法溶剂的要求是：以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度在220~240nm范围内不得超过0.40，在241~250nm范围内不得过0.20，在251~300nm范围内不得过0.10，在300nm以上不得过0.05。
    UV检测器的工作原理是Lambert-Beer定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比：
            A＝lg＝lg＝ECL
式中I0为入射光强度，I为透射光强度，T为透光率，E为吸收系数。
    UV检测器分为固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵列检测器(photodiode array detector，PDAD)。按光路系统来分，UV检测器可分为单光路和双光路两种。可变波长检测器又可分单波长（单通道）检测器和双波长（双通道）检测器。PDAD是80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质），色谱用于定量。常用于复杂样品（如生物样品、中草药）的定性定量分析。
4．与检测器有关的故障及其排除
1）流动池内有气泡
  如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状“峰”，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。
2）流动池被污染
    无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。
3）光源灯出现故障
    紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。
4）倒峰
    倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。

五、数据处理和计算机控制系统
    早期的HPLC仪器是用记录仪记录检测信号，再手工测量计算。其后，使用积分仪计算并打印出峰高、峰面积和保留时间等参数。80年代后，计算机技术的广泛应用使HPLC操作更加快速、简便、准确、精密和自动化，现在已可在互联网上远程处理数据。计算机的用途包括三个方面：①采集、处理和分析数据；②控制仪器；③色谱系统优化和专家系统。
六、恒温装置
    在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。
    温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般来说，温度升高，可提高溶质在流动相中的溶解度，从而降低其分配系数K，但对分离选择性影响不大；还可使流动相的粘度降低，从而改善传质过程并降低柱压。但温度太高易使流动相产生气泡。
    色谱柱的不同工作温度对保留时间、相对保留时间都有影响。在凝胶色谱中使用软填料时温度会引起填料结构的变化，对分离有影响；但如使用硬质填料则影响不大。
    总的说来，在液固吸附色谱法和化学键合相色谱法中，温度对分离的影响并不显著，通常实验在室温下进行操作。在液固色谱中有时将极性物质（如缓冲剂）加入流动相中以调节其分配系数，这时温度对保留值的影响很大。
    不同的检测器对温度的敏感度不一样。紫外检测器一般在温度波动超过±0.5℃时，就会造成基线漂移起伏。示差折光检测器的灵敏度和最小检出量常取决于温度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附热检测器也要求在±0.001℃以内。
IV．固定相和流动相
    在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）
    HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1．基质的种类
1）硅胶
    硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有：
①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。与比表面积成反比。
③比表面积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝
    具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
3）聚合物
    以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH13下反复冲洗。
    所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中，因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。
2．基质的选择
    硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。
        硅胶        氧化铝      苯乙烯-二乙烯苯      甲基丙烯酸酯
        耐有机溶剂    +++        +++      ++            ++
        适用pH范围    +          ++      +++            ++
        抗膨胀/收缩  +++        +++      +              +
        耐压          +++        +++      ++              +
        表面化学性质  +++          +      ++            +++
        效能          +++          ++      +              +
        注：+++好 ++一般 +差

二、化学键合固定相
    将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。
1．键合相的性质
    目前，化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm2，由于空间位阻效应（不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上）和其它因素的影响，使得大约有40~50%的硅醇基未反应。
    残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，特别是对非极性键合相，它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的稳定性。结果使碱性组分的峰形拖尾）。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称封端（或称封尾、封顶，end-capping），以提高键合相的稳定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的“湿润”性能。
    由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同，因此具有相同键合基团的键合相，其表面有机官能团的键合量往往差别很大，使其产品性能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
    pH值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响，一般来说，硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用。
2．键合相的种类
    化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。
    常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。
    常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。
    另外C18柱稳定性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故，但C18基团空间体积较大，使有效孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低。
3．固定相的选择
    分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力；氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，故被广泛用于糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等，因为它们之间会发生反应生成Schiff 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。
    分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相。利用特殊的反相色谱技术，例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键合相，它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能


    用于极性化合物的分离，而苯基键合相适用于分离芳香化合物。
    另外，美国药典对色谱法规定较严，它规定了柱的长度，填料的种类和粒度，填料分类也较详细，这样使色谱图易于重现；而中国药典仅规定填料种类，未规定柱的长度和粒度，这使检验人员难于重现实验，在某些情况下还浪费时间和试剂。
三、流动相
1．流动相的性质要求
    一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
    选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。因此，k值是流动相组成的函数。塔板数N一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：
①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。
2．流动相的选择
    在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。
    正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。
    反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。
    在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。

参考资料：
    乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。价格是甲醇的6~7倍。
    反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：
      C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇  C四氢呋喃＝0.66C甲醇
    C为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。
3．流动相的pH值
    采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。
4．流动相的脱气
    HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。
    溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。
    除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。
离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机。
    一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。
5．流动相的滤过
    所有溶剂使用前都必须经0.45µm（或0.22µm）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。
    用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。
6．流动相的贮存
    流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
    磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。
7．卤代有机溶剂应特别注意的问题

卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质，能与HPLC系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解，不能存放太久。卤代溶剂（如CCl4、CHCl3等）与各种醚类（如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等）混合后，可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物，这种混合流动相应尽量不采用，或新鲜配制。此外，卤代溶剂（如CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产生结晶。总之，卤代溶剂最好新鲜配制使用。如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产生类似问题。
8．HPLC用水
    HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱的洗脱。
    进行HPLC、GC、电泳和荧光分析，或在涉及组织培养时，没有有机物污染是非常重要的。测高锰酸钾颜色保留时间的定性方法反应慢，对很低水平的有机物（对HPLC可能还是太高了）不够灵敏，特别是不能定量。总有机碳(TOC)分析仪（把有机物氧化成CO2，测游离的CO2）常用于I类（NCCLS）水中低浓度有机物的测定。
V．HPLC应用
一、样品测定
1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）
5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：
①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。
⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水）。
二、方法研究
1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。
2．流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。

附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则
一、对起草单位的要求：
1．HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时，需提供建立HPLC法的依据及参考文献。
2．应对建立的方法进行论证，按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。
3．建立方法时，应考虑下列事项：
①首选填料为十八烷基键合硅胶，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱。
②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH值应为3~4。
③尽可能选用流动相作为溶剂，如未能选用，应说明原因。
④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品，应与待测物质化学结构相似，理化性质接近，峰的响应值相当，以及分离度应大于1.5，另应考虑对照品的来源问题。
⑤检测器首选UV检测器。
4．采用HPLC法进行有关物质检查时，如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大，应首选自身对照法，而不宜选用面积归一化法。
5．HPLC法用于原料药的含量测定。如以内标法测定含量，应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质；如以外标法测定含量，对照品与供试品应各取样2份，对照晶溶液各进样3次，供试品溶液各进样2次，计算相对标准差（RSD应不得大于l.5％）。
二、对复核单位的要求：
1．按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。
2．当HPLC法用于有关物质的检查时，应进行最低捡出量试验。
3．应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性，并作出评价。

最近在做仪器的验证，对液质有了更深的了解。
想问各位一下，调谐和校准到底是否是一回事？

原文由 sinkerlht 发表:
最近在做仪器的验证，对液质有了更深的了解。
想问各位一下，调谐和校准到底是否是一回事？

可以认为是一回事！

原文由 aspring 发表:
现在是液质仪器是waters一家独大，不过这种情况有望被Agilent打破，waters的设备性能稳定，做工精量，不过长期独霸市场让其有一股舍我其谁的气势，这种气势很好，但如果还没有做到盖世无双，这在市场竞争中就是妄自尊大；虽然 Agilent 的液质仪器是新品， 不过凭借着气相 液相色谱仪的良好性能，估计其液质也不会差到哪里去，所以现在很期待，能够实际用一下，感受一下两者的区别。

无知者无畏阿.....真敢说阿.....
你打个电话问问看waters说不说自己是在MS行业一家独大？
我服了您了....

建议您搜索看看AB，finngan是什么的干活....