主题：【求助】山楂薄层色谱

山楂黄酮的薄层色谱分离鉴定研究
A STUDY ON SEPARATION AND IDENTIFICATION OF FLAVONOIDS IN CRATAEGUS PINNATIFIDA BGE.BY THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY
<<林产化学与工业 >>2003年04期
梁淑芳 , 马耀光 , 马柏林

研究了山楂(山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br)黄酮类化合物新的薄层色谱分离鉴定方法.以十二烷基硫酸钠-正丁醇-正庚烷-水微乳液为展开剂,利用聚酰胺薄层色谱法能使山楂黄酮完全分离.从山楂叶中分离得到7个黄酮斑点,山楂果中得到7个黄酮斑点,但二者的斑点不完全相同.与用正丁醇∶乙酸∶水4∶1∶5为展开剂的聚酰胺薄层色谱法比较发现,微乳薄层色谱法检测灵敏度高、分离效果理想.

脂清胶囊质量标准的研究
摘要：目的建立脂清胶囊（虎杖，山楂，当归等）的质量标准控制方法。方法采用薄层色谱法（TLC）对处方中山楂、当归进行定性鉴别；采用高效液相色谱法(HPLC)对虎杖中大黄素进行含量测定。高效液相色谱条件： Agilent1100，ODSC18柱，流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）。结果山楂、当归的薄层色谱图斑点清晰，具有专属性；大黄素在0.306~0.816 μg范围内线性关系良好，r＝0.999 9，平均回收率为99.22％，RSD为2.4％。结论 该方法能准确可靠地进行定性、定量检测，能有效地控制脂清颗粒的质量。
脂清胶囊是由虎杖、山楂、当归3味药材制成的中药复方制剂，具有活血降浊，润肠通便之功效，用于瘀浊内盛而致的高脂血症。是我院临床应用多年，疗效确切的制剂。原标准仅有理化鉴别而无薄层鉴别和含量测定，为更有效地控制药物质量，本文建立了山楂、当归的薄层色谱鉴别;大黄素的含量测定项。

　　1  仪器与试药

　　Agilent高效液相色谱仪；TU1901双光束紫外分光光度计；SK5200H 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；AY120型电子天平(日本)；硅胶G(青岛海洋化工厂)；山楂对照药材( 92829001)、当归对照药材（9271200110）及大黄素对照品(880200001)（中国药品生物制品检定所）；甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯；脂清胶囊由湖南中医学院药剂科制剂室提供。试剂：甲醇为色谱纯试剂，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

　　2  质量标准

　　2.1  山楂鉴别

　　2.1.1  山楂的TLC取本品粉末1 g，加醋酸乙酯4 ml，超声处理15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。同法制备缺山楂的阴性样品溶液。另取山楂对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述4种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯醋酸乙酯甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液（3→10），在80℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，日光下显相同紫红色斑点；紫外光灯（365 nm）下，显相同橙黄色荧光斑点。结果见图1。

　　2.1.2  当归的TLC  取本品1 g，加甲醇10 ml，超声提取30 min，滤过，滤液作为供试品溶液。同供试品溶液的制备方法制备缺当归的阴性样品溶液。另取阿魏酸对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2000年版Ⅰ部附录ⅥB）试验［1］，吸取上述3种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷－醋酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的颜色荧光斑点。阴性对照溶液无干扰。结果见图2。

　　2.2  含量测定

　　2.2.1  实验条件色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇 -0.1% 磷酸溶液（80∶20）为流动相；检测波长为254 nm；柱温：25℃。流速：1 ml・min-1。理论板数按大黄素峰计算应不低于3 000。

　　2.2.2  测定方法对照品溶液的制备：精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥 24 h的大黄素对照品适量，加甲醇配制成每毫升中含 51 μg 的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品10粒，研细，取约0.03 g各3份，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入氯仿 25 ml 和 2.5 mol/L 硫酸溶液 20 ml ，称定重量，置水浴中分别加热回流 1 ，2，3 h（水温 80 ℃ ），冷却至室温，再称定重量，用氯仿补足减失的重量，摇匀，精密吸取氯仿层 10 ml ，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至 10 ml ，用微孔滤膜（ 0.45 μm ）滤过，取续滤液即得。阴性溶液的制备：按处方制成的缺虎杖的样品0.03g，精密称取，照供试品溶液的制备方法制备。

　　2.3  测定波长的选择取大黄素对照品溶液于TU-1901双光束紫外分光光度计上进行光谱扫描，结果大黄素在254nm波长处有较大的吸收。结果见图3。

　　图1  山楂薄层色谱图（荧光）（略）         

　　图2  当归薄层色谱图（荧光）（略）

　　图3  大黄素的紫外扫描图（略）

　　2.4  空白实验按上述色谱条件，吸取药材溶液、供试品溶液、对照品溶液及阴性溶液各10 μl，分别注入色谱仪中。供试品色谱图中,在与对照品色谱图相应的位置上,有一相同的色谱峰,而阴性溶液在此保留时间无干扰。结果见图4。

　　图4  缺虎杖的阴性样品、大黄素、虎杖、药材、供试品HPLC图谱（略）

　　2.5  方法学考察

　　2.5.1  线性关系　 精密称取大黄素对照品溶液（51μg/ml）,6，8，10，12，14，16 μl 注入高效液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标，进样量为（μg）为横坐标绘制标准曲线。结果表明：大黄素对照品在0.306~0.816 μg范围内线性关系良好，其回归方程为：Y=2428X-53 ，r=0.999 9。

　　2.5.2  精密度实验精密吸取同一供试品溶液，连续重复进样5 次，每次10 μl，测定峰面积值，结果RSD为0.52 ，精密度良好。

　　2.5.3  重复性实验取同一样品5份，按含量测定项下的方法分别测定，结果RSD为1.72 ，样品测定有良好的重复性。

　　2.5.4  稳定性实验　取同一供试品溶液，25℃室温放置，按含量测定项下的色谱条件测定其峰面积,分别于0，4，8，12，16 h进样，每次10 μl，结果RSD为1.17 ,说明样品在16  h内是稳定的，满足测试要求。

　　2.5.5  回收率取已知含量（64.2 mg/g)的样品约为16 mg，精密称定，共取5份，分别精密加入大黄素对照品溶液(浓度为0.51 mg/ml)2 ml，根据上述供试品溶液的制备方法制备和测定， 按外标法以峰面积计算供试品中大黄素的量，计算回收率。结果见表1。结果表明平均回收率为99.22％ ,方法可靠。

　　表1  回收率实验（略）

　　2.6  样品测定取样品10批,按含量测定方法分别精密吸取对照品与供试品溶液各10 μl，注入色谱仪,按外标一点法计算样品含量。结果见表2。

　　表2  样品测定结果（略）

　　3  讨论

　　3.1  虎杖为方中君药，大黄素为其活血化淤、降血脂的主要成分，故本文采用HPLC法测定大黄素的含量来达到控制制剂的目的。

　　3.2  检测波长的选择：取大黄素对照品溶液在200～600 nm波长范围内进行扫描，结果大黄素在254 nm波长处有较大的吸收, 分别吸取药材溶液、供试品溶液、对照品溶液及阴性溶液各10 μl注入色谱仪中，供试品色谱图中,在与对照品色谱图相应的位置上,有一相同的色谱峰,而阴性溶液在此保留时间无干扰。故选定测定波长为254 nm。

　　3.3  在样品前处理方法考察中,我们比较了超声,回流等不同的提取方法,结果表明，采用回流提取的方法，分离效果好，重复性良好，且空白制剂无干扰，可以用于控制该制剂的质量。

　　3.4  方法学研究表明，采用薄层色谱法对处方中的山楂、当归进行定性鉴别斑点清晰，专属性好；采用高效液相色谱法对虎杖中大黄素进行含量测定，结果准确，重复性好，能有效控制产品质量。

　　参考文献：

　　［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部 ［S］. 北京：化学工业出版社，2005：145.

山楂化滞丸
拼音名：Shanzha Huazhi Wan
英文名：
书页号：2000年版一部-361

【处方】　山楂 500g 麦芽 100g 六神曲 100g
槟榔 50g 莱菔子 50g 牵牛子 50g
【制法】　以上六味，粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末加红糖25g 及炼蜜90
～100g制成大蜜丸，即得。
　　【性状】　本品为棕色的大蜜丸；味酸、甜。
　　【鉴别】　(1) 取本品，置显微镜下观察：果皮石细胞淡紫红色、红色或黄棕色，
类圆形或多角形，直径约至125μm。果皮细胞纵列，常有1 个长细胞与2 个短细胞相间
连接，长细胞壁厚，波状弯曲，木化。内胚乳碎片无色，壁较厚，有较多大的类圆形纹
孔。种皮栅状细胞淡棕色或棕色，长48～80μm 。种皮碎片黄色或棕红色，细胞小，多
角形，壁厚。
　　(2) 取本品9g，切碎，加硅藻土适量，研匀，加甲醇50ml，置水浴上回流30分钟，
滤过，取1ml滤液备用；剩余滤液置水浴上蒸干，残渣加稀盐酸5ml溶解，滤过，取滤液
2ml,加碘化铋钾试液2 滴，生成红棕色沉淀；另取滤液2ml,加硅钨酸试液2 滴，生成白
色沉淀。
(3) 取[鉴别](2) 项下的甲醇滤液作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制
成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述两
种溶液各10μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶Ｇ薄层板上，以氯仿－
丙酮(9:1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在 105℃加热数分
钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
　　【检查】　应符合丸剂项下有关的各项规定（附录Ⅰ A）。
【含量测定】 取重量差异项下的本品3g，剪碎，精密称定，加水10ml，放置使溶散，
滤过；药渣再用水10ml洗涤，在室温干燥至呈松软的粉末状，在100℃烘干，连同滤纸一并
置索氏提取器内，加乙醚适量，加热回流提取4小时，提取液回收乙醚至干，残渣用石油醚
（30～60℃）浸泡2次，每次5ml（浸泡2分钟），倾去石油醚，残渣加适量无水乙醇-氯仿（
3：2）混合液，微热使溶解，转移至5ml量瓶内，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
另取熊果酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，分别精密吸取供试品溶液6μl及对照品溶液4μl与8μl,
交叉点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸（20：5：8：0.1）为展开剂，
展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热5～7分钟，至斑点显色清晰，取出，
在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法（附录Ⅵ B薄层扫描法）
进行扫描，波长：λs=535nm，λR=650nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，
计算，即得。
本品每丸含山楂以熊果酸（C30H48O3）计，不得少于4.5mg。
　　【功能与主治】　消食导滞。用于停食停滞，食少纳呆，大便秘结，脘腹胀满。
　　【用法与用法】　口服，一次2丸,一日1～2次。
　　【注意】　孕妇忌服。
　　【规格】　每丸重9g
　　【贮藏】　密封。

首乌降脂减肥丸的质量标准
作者：邹昱蕾，陈霞 来源：中华现代中医学杂志
【摘要】  目的  建立山楂、丹参薄层色谱方法及大黄、檀香的理化鉴别方法。方法  采用薄层鉴别山楂、丹参；采用理化鉴别大黄、檀香。结果与结论  鉴别专属性强，方法简便、准确。


    【关键词】  首乌降脂减肥丸；制备工艺；质量标准


      首乌降脂减肥丸为我院名老中医之验方，该方具有调养肝肾、通脉降脂、活血化瘀、软化扩张动脉血管、调节血脂、血糖代谢之功效。可用于各种年龄的单纯性肥胖和超标体重的肥胖者。该方在我院临床运用十余年，疗效确切，深受医患好评。为了便于服用、携带方便及保存，我们将其制成水泛丸，并制定了其质量标准，确保该药的质量和临床疗效。


    1  仪器和试剂


    BY-型糖衣机(上海中联制药机械厂)；FN202-2A型电热干燥箱(长沙仪器仪表厂)；JL-180电子分析天平(日本)；升降式崩解仪(北京医疗设备四厂)；XSP-18B显微镜(江南光学仪器厂)；UV-1型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；熊果酸、丹参对照品(中国药品生物制品检验所)；试剂均为分析纯。


    2  制备工艺


    2.1  处方  炙首乌、生三七、丹参、生山楂、粉葛、檀香、生大黄等。


    2.2  制法［1］  按处方量扩大1000倍，将上述药物精选，洗净，烘干，粉碎成细粉，过100目筛，混匀，用纯化水作为赋形剂泛丸，干燥，打光，分装，即得。


    3  质量标准


    3.1  薄层色谱鉴别［2］  (1)取本品粉末1g，加醋酸乙酯4ml，超声处理15min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(药典附录ⅣB)试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(20：4：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(3→10)在80℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显紫红色斑点；紫外光灯(352nm)下，显橙黄色荧光斑点(色谱图见图1)。(2)取本品粉末1g，加乙醚5ml，置具塞试管中，振摇，放置1h，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取丹参酮ⅡＡ对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(药典附录ⅣB)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(19：1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点(色谱图见图2、图3)。


    3.2  理化鉴别［3］  (1)取粉0.2g，加10%硫酸溶液10ml，氯仿10ml，回流15min，冷却后移入分液漏斗中，氯仿层加氢氧化钠试液5ml，碱液层呈红色。(2)取粉燃烧，有香气，发出吱吱声。


    3.3  其他  检查应符合《中国药典》2005版一部丸剂项下有关规定(附录IA)。


    4  讨论


    (1)处方成分中含有具粘性成分的原料(如山楂)，所以仅用纯化水湿润即可诱发其粘性而泛丸，又因水不容易在粉末中均匀分布，故泛丸时以雾状喷入即可克服此弊端。虫胶具有绝缘、粘着、防潮、防霉的作用，在中医上还有清热、凉血、解毒之功效，故丸粒上光采用虫胶乙醇溶液，既保证了药性，又保证了丸粒的圆整性、光亮度。(2)进行理化鉴别时，取药量及试剂量可适当放大，以使现象为显著。(3)分别对处方中用量较大的山楂、丹参进行薄层色谱鉴别，干扰小，现象显著，证明方法可靠、准确。(4)本质量标准已通过市药检所复检合格，可列为该药的质量标准。


    【参考文献】


    1  杨基森.中药制剂设计学.贵阳：贵州科技出版社，1992，340.


    2  药典委员会编.中国药典(一部).北京：化学工业出版社，2005，附录IA.


    3  孙长荣.中药材理化鉴定.石家庄：河北科学技术出版社，1993，423.


    作者单位： 650011 云南昆明，昆明市中医医院制剂科

原文由 cthy 发表:
水煎处理的山楂是否检不到熊果酸成分，如果用薄层检查，可检查什么成分，如何处理样品，以什么为对照？请指教，谢谢先。

山楂