离子对试剂与HPLC

离子对试剂介绍

离子对试剂的优点

在过去，带电荷分析物的色谱分离通过离子抑制（小心调节流动相PH值以使分析物非离子化）来达到。然而，要确定离子抑制状态下的最佳流动相PH值，却往往需要额外的摸索过程。含有一个以上的可离子化成分的样品，通常是不稳定的。离子抑制的局限性导致了一种新的、更普遍适用的方法进行可离子化物质色谱分离的方法：离子对色谱。

离子对色谱由Gordon Schill博士于1973年建立，其方法是将离子性化合物添加到流动相中以促使离子与带电荷分析物形成配对离子。这些试剂由带有可离子化终端的烷基链组成。当在反相条件下用于常见的憎水性HPLC固定相时，离子对试剂可选择性的增加带电荷分析物的保留时间。

尽管离子交换色谱已经成为常见的分离模式，它并非在所有情况下都起作用。较离子交换色谱，离子对色谱的优点在于：

ü 缓冲液制备简单；

ü 碳链长度选择众多，可用于增加保留时间、改善分离性质；

ü 显著缩短分离时间；

ü 同时分离离子化和非离子化分析物；

ü 分析结果重现性极好；

ü 改善峰形。

Regis提供的离子对试剂

Regis生产超纯的阴离子磺酸盐（S-系列）和阳离子季胺（Q-系列）离子对浓缩液，碳链长度有：戊、己、庚、辛和月桂(十二)。在我们的产品命名中，碳链长度以红色数字标出，如：5，6，7，8和12。

纯度是关键因素

在我们生产离子对试剂的过程中，纯度是非常重要的质量标准。Regis S-和Q-系列离子对试剂根据工业最高质量标准进行合成，从而得到超乎寻常的纯度。这一点可参见表1：在波长低至200nm时对于Regis S-和Q-系列离子对试剂均可达到紫外透过性。在大部分情况下，这些紫外吸收值要低于用于HPLC梯度洗脱的乙腈和甲醇的紫外吸收值。尽管S-和Q-系列离子对试剂能在低于210nm的波长下使用，决定使用什么波长的关键因素还是在于检测器镜片和有机该性剂（如甲醇等）的综合情况。

Regis还提供批量磺酸盐和几种补充批量离子对试剂以及Rivier缓冲剂以补充磺酸盐S-系列和季胺Q-系列的分离能力。

如何为分析方法的建立选择合适的Regis离子对试剂

要选择合适的试剂，必须考虑烷烃长度。不同的烷烃链长度使得能够选择性分离分析物。链越长，离子对的憎水性越强，从而，保留时间也就越长。当链长度由戊基(Q5)增加到月桂基(Q12)时，保留因子几乎增长了20倍，如表2和表3所示。表2和表3中的数据显示出Q-试剂链长度决定了苯甲酸的保留时间，但不会影响到苯甲醇的保留时间。对于S-系列试剂也可以观察到类似的选择性。

以下是使用Regis离子对试剂来成功建立分析方法的指导：

1. 选择一根色谱柱，常为C18柱；

2. 准备流动相时仅使用HPLC级别的水和色谱级试剂；

3. 选择能给出最佳分离度的流动相成分和浓度；

4. 如果样品中有非离子化物质，在尝试离子化分离之前首先优化分离情况；

5. 选择合适的离子对系列试剂以提供相应的离子配对：对于酸性分析物使用Q-系列离子对试剂；对于碱性分析物使用S-系列离子对试剂；

6. 通过比较选择所得分离度最好的离子对试剂；

7. 一旦离子对试剂已经确定，调节流动相的pH值将分离度最大化；因为微小的pH值改变对保留性质和选择性都有较大的影响，所以仔细小心的小幅度调节pH值（参见表3）；

8. 理想状况下，流动相中的离子对试剂浓度应为0.005M，但是稍微增加离子对试剂可能会稍微增加保留性质并因此优化分离情况。

2.2 高效液相色谱分离

HPLC-ICP-MS联用技术在元素化学形态分析中的应用，已有文献总结；该技术的优点是应用范围广。以下是几种常用于形态分析的HPLC技术。

2.2.1 体积排阻色谱(SEC)

SEC是按溶质的分子大小来分离的。其优点是：未知分子质量的样品在末端时间或在此之前淋出，因而可以预测色谱运行的终点；未知物的分子质量可以用校正的色谱系统来表征。SEC通常不会引起元素形态的丢失，适用于不稳定或与金属络合较弱的生物大分子。缺点是容量有限，不能分辨多组分样品，仅能分离分子大小不同且不能吸附在柱上的分析物。此外，有些化合物的保留时间会迁移至淋洗体积的末端以外，有时还会产生吸附效应和憎水效应，这些现象均会导致化学形态的转变和破坏。

2.2.2 离子交换色谱(IEC)

与SEC相比，IEC最主要的优点是分离效率高，应用范围广。分离过程基于带电溶质离子与固定相的反电荷表面的交换平衡。溶质离子与流动相中的等电荷离子竞争固定相上的反离子。这种竞争决定了离子的相对保留时间，它依赖于流动相的pH值、离子强度和离子交换剂的性质。淋洗液中如含有高浓度的盐类，将会影响与ICP-MS的接口。

此外不稳定的金属-蛋白的络合物中的金属会被缓冲液中的金属所代替。所以，IEC经常应用于以共价键结合的硒氨基酸或砷化合物。

2.2.3 反相高效液相色谱(RP-HPLC)

RP-HPLC利用极性较流动相弱的固定相来分离分析物。保留机制是基于分析物的憎水性。该方法的应用范围广，对不同形态的分辨率高，重复性好。但是，固定相有离子交换性质，在pH>4时碱性分析物在柱上的吸附力很强。一般应用两种不同的淋洗液，其中至少有一种含有相当量的有机改进剂。淋洗生物分子需要用有机溶剂，还经常需要用酸。有机溶剂和酸很容易改变形态如蛋白-金属络合物。蛋白质被打开后，释放的金属即与其它络合剂结合导致形态改变。所以，RP-HPLC适用于分离以共价键结合的金属络合物而不适用于不稳定的金属络合物。

2.2.4 离子对色谱(IP-RPLC)

RP-HPLC仅能分离非极性不带电的分析物。在分离带电的极性分析物时需要用离子对试剂。固定相是标准硅烷化的硅胶填料(如C₈或C₁₈。)，流动相是由如磷酸盐或醋酸盐、有机改进剂(甲醇或乙腈)和离子对试剂组成的水溶液缓冲体系。离子对试剂与分析物生成离子对保留在反相柱上。离子对试剂参与流动相中分析物与非极性固定相之间的平衡。在考虑离子对试剂时应尽量用溶于流动相的去质子的一价反离子，并对色谱柱和分析物不造成损害。用缓冲溶液控制水相的pH值和反离子的浓度以避免峰拖尾和出现多峰至关重要。与RP-HPLC相比，IR-RPLC的优点是方法的灵活性和多样性增加了。可以为一种特定的要求来设计分离条件。但是，方法所用的有机溶剂和酸也会影响元素的形态。离子对试剂更加重了这些问题，于是对分析物的稳定性的要求比单独使用RP-HPLC更高。

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