主题：【原创】色谱技术在生命科学中的应用

因为本人目前主要从事液相色谱的使用，因此，先向大家说一说液相色谱。

主要参考清华大学分析仪器教程

    在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。
　　气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。
    在生命科学的应用上，液相色谱的使用远远大于气相色谱。。。

    广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。

　　通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。表中列举了一些液相色谱方法。按分离机理，有的相同或部分重叠。但这些方法或是在应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。


  类 型            主要分离机理      主要分析对象或应用领域
                
吸附色谱             吸附能，氢键    异构体分离、族分离，制备
分配色谱             疏水分配作用    各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱             溶质分子大小    高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱    库仑力             无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱    Donnan膜平衡    有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱    疏水分配作用    离子性物质分析
疏水作用色谱    疏水分配作用    蛋白质分离与纯化
手性色谱             立体效应             手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱             生化特异亲和力    蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析

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液相色谱仪流程图


　　现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。图8-1是具有基本配置的液相色谱仪的流程图。


　　液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。

输液泵


　　高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。


　　1. 对输液泵的基本要求

　　
　　流量准确可调。对于一般的分析工作而言，流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流量的测定通常采用热脉冲流量计。

　　
　　耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10粒径）的填料，在高压下填充到柱管中的，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。

　　
　　液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。
　　
　　泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料应耐化学腐蚀。

2. 输液泵

　　
　　输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。

　　
　　输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能总结于表
几种高压输液泵的性能比较

名 称        恒流或恒压  脉冲  更换流动相  梯度洗脱  再循环  价格
气动放大泵      恒压    无      不方便    需两台泵  不可    高
螺旋传动注射泵  恒流    无      不方便    需两台泵 不可 中等
单活塞往复泵    恒流    有      方便      可 可 较低
双活塞往复泵    恒流    小      方便 可 可 高
隔膜往复泵      恒流    有        方便 可 可 中等