SDS-PAGE 是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法,实验成本较低,仪器设备也相对很简单,一套电泳装置即可。一般涉及到蛋白质纯化的实验室基本都具备。但是精确程度相对较低,好的电泳图谱需要一定的技术。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
[原理]
十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便,设备简单等优点。
蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中,主要取决于它在某PH下所带的净电荷量、分子大小(即分子量)和形状的差异性,而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质,主要取决于它们的分子量,与原有的电荷量和形状无关。
SDS是一种阴离子表面活性剂,在一定的条件下,它能打开蛋白质氢键和疏水键,并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物,每克蛋白质一般结合1.4克SDS。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷,其量远远超过蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。在水溶液中,蛋白质-SDS复合物具有相同的构象,近似雪茄烟形的长椭园棒(短轴均为1.8nm,长轴则随蛋白质的分子量成正比变化),克服了蛋白质间原有的形状差异。这样蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响,而只是蛋白质分子量的函数。蛋白质分子量与电泳迁移率间的关系可用下式表示:
lgMr = K – bm
式中 Mr为分子量;K为常数;b为斜率;m为迁移率。
因此,用本法测定蛋白质的分子量只需根据待测蛋白质在已知分子量的标准蛋白质的lgMr~迁移率的图中的位置,就能得知分子量。
用本法测得的分子量,除单链蛋白质外,均不是天然蛋白质的完整分子量,而是组成这些蛋白质的亚基或肽链的分子量。本法对一些电荷异常,或构象异常,或带有大辅基的蛋白质不适用,如组蛋白F1和某些糖蛋白等。对一些结构蛋白如胶原蛋白等也不适用。
具体实验方法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量