主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之十五）

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发表于：2008/11/28 07:21:50 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

高效薄层色谱法（HPTLC）测定饲养动物肉中磺胺类药物的残留量（EEC,Sg3.2筛选法）
Sulphonamides-Screening Method Using HPTLC for the Detection of Sulphonamides in the Meat of Farm Animals
(EEC,Sg3.2 Screening Method)

安全操作注意事项及急救
有机溶剂：所有有机溶剂都必须按危险品处理，所有操作都必须在通风橱中进行。
1. 溶剂、酸、碱接触皮肤后，必须用大量冷水冲洗，溅入眼睛后，必须用水冲洗并立即进行医务处置。
2. 割伤、划伤：立即进行医务处置。
3. 烧伤和冻伤：烧伤在凉水，冻伤在微热水中敷设10min后，立即进行医务处置。

引言
磺胺类药物是一类广泛地预防性地使用和作为生长刺激剂的抗生素。为了最大限度的减少人们饮食中残留的危害，制定了停药周期。如果不能保证在停药周期内停药，就可能出现超过MRLs的最高残留水平。磺胺类药物的MRL为100μg/kg，氨苯砜是25μg/kg。

1. 主题内容
本方法描述了肉中磺胺类和氯苯砜的检测方法。

2. 应用范围
该方法适用于成年家畜、小牛、猪和家禽肉的检验。该方法被用于荷兰监控人员所抽取的样品组织中磺胺类药物的残留检测，并依据残留指令（86/469/EEC）执行。对肉品中磺胺类药物的最小检测限是1μg/kg。

3. 参考资料
93/256/EEC委员会决议，规定了使用激素或甲状腺抑制物的残留物的测定方法。（OJ.No.L.118,14.4.93.pp 64-74）
ISO标准78/2-1982标准制定—第二部分，化学分析标准。
Beek,W.M.J., Binnedijk,G.M., Smidt,R.A., Keukens,H.J.and deVries,P.H.U.
(1992),Vlees – Screening von sulfonamiden en dapson – HPTLC.RIKILT-DLO. SOP No A0644, DAM code;0800302,Edition 2. Sept. 1992.
The USDA,USA,has developed a pig-side TLC test called the ‘Swine urine screen Sulfa-on-site’ (SOS-test).

4. 定义
磺胺类药物或氨苯砜的含量是用于表示按照所描述的方法检出的肉中的磺胺类药物或氨苯砜的量，并以μg/kg表示。
5. 方法提要
该方法包括4个步骤
—均质并用二氯甲烷提取；
—使用Sep-Pak 硅胶处理柱以磷酸盐缓冲液净化；
—用乙酸乙酯反提取；
—在硅胶平板上进HPTLC色谱分离，荧光检测。

6. 仪器及试剂
注意：在方法中所引用的试剂（包括仪器）的产地、型号是适用的，其它产地、型号试剂（仪器）可等同使用，所有试剂必须是分析纯以上。
6.1 化学试剂
6.1.1 丙酮
6.1.2 n-丁醇
6.1.3 氯仿
6.1.4 二氯甲烷
6.1.5 磷酸氢二钾K2HPO3
6.1.6 乙酸乙酯
6.1.7 荧光胺
6.1.8 甲醇
6.1.9 氢氧化钠
6.1.10 硫酸钠
6.1.11 石油醚
6.1.12 蒸馏水
6.1.13 磷酸
6.2 溶液
6.2.1 0.1mol/L氢氧化钠：溶解4g NaOH于1L水中。
6.2.2 0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH=10：溶解4.36g K2HPO3 (6.1.5)于400mL 水中，用NaOH溶液(6.2.1)调节pH至10，用水定容至1L。
6.2.3 HPTLC溶液：氯仿-正丁醇（4：1）当天使用。
6.2.4 荧光胺溶液：溶解5mg 荧光胺（6.1.7）于50mL丙酮中，该溶液在暗处可保存两周。
6.2.5 0.5 mol/L磷酸：将大约50mL水加入刻度量筒中，然后仔细加入3.4mL磷酸(6.1.13)，用水定容至100 mL 。
6.3 标准物质
6.3.1 磺胺类药物标准品
6.3.2 标准贮备液：100 μg/mL，精密称取约10mg标准品于100mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度，在4-8℃暗处保存，其稳定性不能超过1个月。
6.3.3 标准工作液：1μg/mL，吸取1mL 标准贮备液（6.3.2）于100mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，在4-8℃暗处保存，不超过1个月。
6.3.4 加标样品溶液：1μg/mL，吸取1mL标准储备液（6.3.2）于100容量瓶中，
用水稀释到刻度，当天新鲜配制。

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2008/11/28 7:22:06 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

7. 仪器设备
7.1 分析天平
7.2 天平
7.3 振动混匀器
7.4 Stomacher 400（Labblender）
7.5 超声水浴（Bransonic 32）
7.6 离心机
7.7 玻璃棉或滤纸(S&S 595 1/2 φ15cm)
7.8 Sep-Pak硅胶处理柱（Waters - 51900）
7.9 对Sep-Pak小柱的抽取系统
7.10 具有氮气挥发系统的加热装置
7.11 HPTLC板：10×10cm,Kieselgel 60无荧光指示剂（Merck - 5631）
7.12 .微量吸管：5mL
7.13 TLC层析槽：10×10cm平板
7.14 厨房用搅拌器（Moulinette or Waring）
7.15 注射器：50mL，2mL
7.16 其它标准器皿
7.17 透照仪（UV）366nm
7.18 pH试纸：pH 5-9
7.19 pH计
7.20 Stomacher bags 1L
7.21 Camay Unispray kit (Camag）
7.22 黄-绿荧光斑点，摄显影装置，推荐的显影用滤光片是Wratten No 2E,Kodak CC10M和Wratten 1A 。在f8和600plus偏振片下曝光22.5秒。

8. 样品和取样程序
有关要求见ISO文件78/2-1982 6.3.1节，下列注释引自2052/VI/84EN附录Ⅱ。
8.1 样品的性状：样品应符合64/433/EEC指令中测定肉品中药物残留的要求。
8.2 样品量：样品量应满足测定方法及复验所需量的要求。
8.3 样品的保存和包装必须达到在实验室中正确辨识的要求。
8.4 样品的包装、贮存以及运输必须保持样品的完整性，并且不对检验结果造成任何偏差。检验磺胺类药物的样品必须存放在-18℃以下。

9. 测定步骤
9.1 质量控制：将已知未用磺胺类和氨苯砜处理和污染的动物肉均质后作为空白样品和阳性控制样品，并存放于-20℃直到分析之日。对于阳性控制样品加入相当于10μg/kg的磺胺类或氨苯砜于空白肉中，放置15分钟后再进行混匀。
9.2 试验用肉样品经混匀后在-20℃存放直到分析之日。
9.3 预提取
家禽肉（鸡）
9.3.1 称取10g均质后的肉，作为9.1和9.2的样品，然后用25mL二氯甲烷在Stomacker 中混合，用Stomacher提出取2分钟，通过玻璃棉过滤到100mL烧杯中，再重复提取两次，进入9.4步骤。
9.3.2 家畜和猪肉
称取10g均质肉作为9.1和9.2的样品，然后与25mL二氯甲烷在烧杯中混合，放入超声水浴中10分钟，温度不得超过40℃，通过玻璃棉过滤到100mL烧杯中，再重复提取二次。
9.4 在合并的二氯甲烷提取液中加入25mL石油醚。
9.5 Sep-Pak柱净化
9.5.1 取50mL接收器皿与Sep-Pak小柱相联结（7.8）。
9.5.2 将全部预提液(9.4)放入柱子。用5mL二氯甲烷冲洗烧杯，并转移该溶液到柱子中（注:50mL体积用轻微的抽吸，使其在大约15分钟通过柱子）。
9.5.3 用5ml pH 10磷酸盐缓冲液（6.2.2）洗脱磺胺类药物，收集第一个3mL于刻度试管中。
9.5.6 用pH试纸(7.18)控制pH，用磷酸(6.2.5)或用氢氧化钠(6.2.1)调节pH到6.5至7)。
9.6 用1mL乙酸乙酯在振动混合器上，振动30秒提取洗脱液（9.5.4），用台式离心机分层。转移0.5mL乙酸乙酯层于4mL小瓶中，在氮气流下挥发至干，加入50ul乙酸乙酯用旋涡混合器溶解残渣。
9.7 HPTLC
9.7.1. 用9.7.1.1中方案，吸取10ul样品提取液于层析板底部1.5cm处，斑点间隔约0.75-1cm距离，用氮气流控制溶剂在板上的挥发。滴放质量控制提取物，标准物质和参照样品如9.7.1.1所述。
9.7.1.1 在层析板的底部边缘1.5cm，从左至右排列斑点。
1.标准溶液 2.空白样品 3.加标样品 4.试验样品1 5.试验样品2
6.试验样品3 7.标准溶液 8.试验样品4 9.试验样品5 10.试验样品6
11.参考标准 12.标准溶液
9.7.2 放入溶剂（6.2.3）于层析糟中，深度为0.5cm，让其平衡30分钟。
9.7.3 将层析板放入溶剂中，让该溶剂体系运行4cm。
9.7.4 移出层析糟，然后用铅笔标记溶剂前沿位置。
9.7.5 在通风橱中干燥层析板20min，用荧光胺溶液（6.2.4）喷雾于层析板。5分钟后在366nm紫外灯下，观察层析板。
9.7.6 可以看到具有特征的黄绿色的磺胺类药物斑点。
9.7.7 如果确认是阳性，用铅笔或者用摄影器材（参见7.22）记录斑点。

10. 结果的解释
10.1 感兴趣的磺胺类药物和氨苯砜的Rf值是：（数据来自RIKIT-DLO,NL）。
成分 Rf
磺胺 0.33
磺胺噻唑 0.39
单乙酰基氨苯砜 0.43
磺胺嘧啶 0.57
氨苯砜 0.60
磺胺二甲嘧啶 0.64
Sulphachlorpyrazine 0.69
Sulphaquinoxaline 0.70
磺胺二甲氧嘧啶 0.78
磺胺强力霉素 0.80
10.2 磺胺斑点可看见明显的黄绿色。
10.3 加标空白样品分析必须被检测。
10.4 稳定的斑点如果暴露于光线下或者在暗处放置2小时以内，将非常快的消失。层析板应在喷撒荧光胺30分钟以内进行观察。
10.5 氨苯砜的确认：如果它的代谢产物单乙酰基氨苯砜在层板板中也被检测到，便证实氨苯砜的存在。

11. 特殊事例

12. 方法注意点
荧光斑点在日光下不稳定

13.质量控制

14. 检测报告

15. 缩写语(略)
见手册中12节附录1中缩写

16.检验流程图
均质肉样 → 用二氯甲烷提取 → C18 Sep-Pak → HPTLC → 在UV灯下确认 →用荧光胺喷雾

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