主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之十三）

7. 设备
7.1 气密和水密性反应管，10mL和20mL
7.2 匀浆机（Ultra-Turrax型号）
7.3 磨口抽提管，50mL
7.4 +4℃冰箱
7.5 -20℃低温冰箱
7.6 离心机
7.7 TLC辅助设备，如溶剂罐
7.8 紫外灯（UV），366nm，带参比滤光片或保护性的色谱镜

7.9 玻璃柱，长约300mm，内径4mm，外径6mm
7.10 200mL的玻璃烧瓶（带B14玻璃接头）
7.11 平口针尖的微量注射器（1μL，10μL，100μL）
7.12 汞化树脂的制备
20mL Dowex1χ2（50-100目，分析级）连续用10倍于填充物体积的蒸馏水、0.5M NaOH、蒸馏水、0.5M乙酸、蒸馏水冲洗。将湿树脂（20mL）与200mL2，7-二溴-4-羟基汞基荧光素水溶液（500mg溶于200mL水中）混合震荡24小时。汞化的树脂再用水洗至洗脱液无色。再用100mL 0.1M HCL、0.5M NaCL处理、500mL蒸馏水水洗、100mL 0.1M NaOH处理、500mL蒸馏水水洗，树脂保存于暗处。
7.13 净化过程所用层析小柱的制备
见图 （1）玻璃柱，内径4mm，外径6mm
（2）玻棒，内径3mm
（3）与硅胶管连接
（4）硅胶管，内径0.3mm，外径0.7mm
（5）硅胶管，内径0.5mm，外径1mm
（6）硅胶管，内径0.5mm，外径4mm
（7）玻璃漏斗
R-----树脂
柱充满水后移去玻棒，约含0.6mL的汞化树脂水悬浮液通过漏斗加入至树脂沉淀高为5cm，移去多余的树脂并加玻棒于树脂之上。柱备用。
7.14 HPTLC
7.14.1 薄层板：涂有硅胶60的铝板，无荧光显示剂（如Merck No. 5613或5547）。薄层板使用前110℃活化并放置过夜。
7.14.2 溶剂： 可选用系统A或系统B。
系统A：
7.14.2.1A 第一次展开剂：三氯甲烷：乙醇 95：5（V/V）
7.14.2.2A 第二次展开剂：三氯甲烷：丙酸 95：5（V/V）
系统B：
7.14.2.1B 第一次展开剂：二氯甲烷：甲醇 98：2（V/V）
7.14.2.2A 第二次展开剂：二氯甲烷：丙酸 98：2（V/V）
7.14.3 显色剂： 参见6.11
上列试剂生产公司及产品仅供参考，相当试剂同样合适。

8. 样品及取样程序
8.1 样品属性：样品应符合64/433/EEC指令中，关于进行肉样中进行兽药残留检测的要求。如果没有此类肉样，也可用动物的体液或排泄物作为样品来进行残留检测。
8.2 样品量：其数量必须满足本实验要求，必要时须满足复验所需的量。
8.3 样品的传递与包装须满足实验室的能正确识别的要求。
8.4 包装、保存、运输的方法必须保持样品的完整性并不致产生检验结果的偏差。分析甲状腺抑制物的样品的保存与运输须在-18℃以下。

9. 测定步骤
9.1 取动物组织2g，2mL尿，血浆或脱脂奶，加入10mL甲醇后用一Ultra-Turrax匀浆机（7.2）匀质。
9.2 加入含0.2μg内标DMTU的溶液100μL（6.12.2），匀浆液用10，000rpm（12,000g）离心10分钟。
9.3 倾出上清液，过汞化柱（7.13）。小心上下移动玻棒赶去气泡。

9.4 10mL水洗柱后，甲状腺抑制物随5mL洗脱液（6.7）洗出。
9.5 100μL 4M NaOH和1mL缓冲液（6.12.4）中和洗脱液，并调PH=8。
9.6 加入0.1mL试剂（6.8），40℃黑暗处反应1小时。最佳反应时间依赖于NBD-Cl的性能，在1-2小时间变化。须预先确定最佳反应时间。
9.7 滴加0.2mL 6M HCl调整反应混和物的pH为3-4。
9.8 先后用3mL、2mL、2mL乙醚抽提NBD衍生物，无水硫酸钠（0.5-1g）干燥抽提混和物。不得有水。
9.9 根据检测的浓度需要，用氮气流吹去乙醚，使混和物体积在0.2-1mL。
9.10 混合0.1mL的标准品储备液于5mL缓冲液（6.12.4）中预备衍生化。依照9.6—9.9的步骤衍生化，蒸发乙醚至体积为2mL。
9.11 用50-100μL提取物（9.9）进行双向HPTLC展开。
9.12 薄层板先在第一展开剂（7.14.2.1A/B）中层析，小心吹干后再在第二展开剂（7.14.2.2A/B）中层析。
9.13 标准品在与样品同时衍生化后，可与样品抽提物平行进行第二次展开，以便准确的判别各个甲状腺抑制药物。
9.14 用半胱胺酸的显色剂对展开后的薄层板进行喷雾显色来判别斑点。在未喷显色影剂前斑点无法看见，显色后样品在兰色背景下呈黄色荧光点。在366nm下以可疑的甲状腺抑制物和内标物的相对荧光强度进行比较来检测。
注：薄层板放置过夜将可减少检测干扰物质。

10. 结果计算
10.1 鉴别
阳性样品斑点呈黄色、荧光状，应与标准品有相同的Rf值。使用7.14.2.1A和7.14.2.2A展开剂，与内标DMTU的相对Rf值应与表1中的数值相当。
表1. HPTLC法甲状腺抑制物与DMTU的RRf
甲状腺抑制物 第一次展开后的RRf 在第二次展开后的RRf
DMTU 1.0 1.0
TU 0.34 0.22
MTU 0.59 0.43
PTU 0.73 0.77
PhTU 0.94 0.89
TAP 1.09 0.53
数据来自EEC工作文件VI/3186/84-EN，文件6.21 II-4
10.1. 回收率
经汞化柱后甲状腺抑制物TU、MTU、PTU、DMTU的回收率>78%，而PhTU为17%，TAP 60%。
添加至肉、血浆、奶中的内标物、DMTU的回收率见表2
表2. 100μg/kg DMTU添加回收率
样品 检测的结果±SD（μg/kg）
PTU MTU TU
肉 106±5.5 102±13.7 97±21.8
血浆 84±6.2 98±5.0 76±5.7
奶 88±6.9 105±3.6 85±8.0
10.2 准确度
10.2.1 重现性：按添加浓度100μg/kg加入至肉样品中，对方法的每一测定步骤进行精密度实验，其重现性测定结果见表3，数据由De Brabander、Verbeke、GhenT提供。
步骤 N 回收率
平均值±SD（μg/kg） 变异系数（%）
柱层析 26 81±3.9 4.8
衍生化 26 76±5.0 6.6
HPTLC 22 88±4.7 5.4
总过程 22 55±6.9 12.6

11-15． 略
见附录I，第12部分。

16. 检验流程图
动物组织 加入甲醇与内标物 匀质 汞化柱渗滤

衍生化 HPTLC 366nm荧光检测

结果计算