主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之二十三）

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一道黑

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发表于：2008/12/01 07:16:26 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

牛肝中己烯雌酚和玉米赤霉醇的测定和确证
Determination and Confirmation of Diethylstilbestrol and Zeranol in Bovine Liver

5. 051A 方法提要

本法采用三相溶剂来提取肝样，即使用缓冲液，乙腈、二氯甲烷和正已烷。这种方法能有效地在进柱前去除提取液中甘油三酸酯和非极性物质，当样液过柱净化时，不会导致回收率下降和馏份分成三种极性组别。在氯化物架上有季胺基团阴离子交换树脂的交换柱能富集己烯雌酚和玉米赤霉醇。在pH值大于12时，这些成分的酚盐的阴离子对树脂具有很强亲和性。组织样的乙腈提取液经浓缩碱化后，再经离子交换。几种溶剂洗涤，除去干扰组分，用5%的醋酸清洗可以除去原来在交换树脂的大量干扰阴离子物，再用尽可能少的25%甲醇水溶液清洗交换柱，除去残留醋酸和其他的共提取物，最后用甲醇洗脱。这一过程使用自动的杜邦四溶剂Prep I离心柱洗脱装置，可简化样品处理。本方法可同时测定样品中的左环玉米赤霉醇。

5. 051B 仪器装置
a. 50 mL具螺口盖的聚丙烯离心管（Falcon或相当）。
b. 均质机---Teckmar SDT或相当。
c. 离心机---IEC PR-6000具12孔的转盘或相当，离心 =2500g。
d. 灭菌的一次性吸管。
e. 50 mL具玻塞的离心管。
f. 移液枪，10 mL（Labindustries,Inc.）或相当。
g. 低温培养箱（Precison Scientific, Freas 815型）或恒温水浴（35 - 37oC）或相当。
h. AS型阴离子交换小柱---杜邦化学公司，产品目录号#680316.903。
i. 塑料回收杯---杜邦化学公司，产品目录号#680316.901。
j. Prep I自动样品处理器---杜邦化学公司，产品目录号#680316.908。
k. 闪烁瓶，20 mL（Kimble #74500或相当）。
l. 干燥电热板（Pierce Chem, Co.或相当）。
m. 样品浓缩仪（Fisher,190型）可搁置20 mL闪烁瓶（产品目录#09-549）或相当。
n. 混匀器。
o. 1 mL锥形自动进样瓶。
p. Eppendorf移液管。
q. 一次性移液管，10 mL。
r. GC-MS—惠普5890GC，5970A MSD和9825B计算机，或相当。
s. pH计-—Orion 601A型或相当。
t. 注射器---100 mL。
V．震荡器。

5. 051C 试剂
a. Zearalane---玉米赤霉醇内标物，International Minerals & Chemicals Corp.(IMC)提供。
b. D8Des---DES内标物—（二乙基-1,1,1',1'-d4-己烯雌酚-3,3',5,5'-d4）,MSD同位素（Merck,Sharpe & Dohme Isotopes, Montreal,P.Q）。
c. -匍糖苷酶---H-25型，100，000U/mL()。
d. 乙腈，正乙烷，二氯甲烷，甲醇，乙酸乙酯，异丙醇---高纯级或相当。
e. 玉米赤霉醇---IMC提供。
f. DES---纯度99%（Aldrich,#21894.4）。
g. 己烯雌酚单匍糖苷（DES-MG）（Aldrich,#1644.5）每一安碚瓶相当于1mg游离DES。
h. 水---重蒸馏去离子水。
i. 醋酸---冰醋酸。
j. 衍生化试剂---BSTFA---Pierce Chem. Co., #38830; TMSI---Pierce Chem. Co. #88623.
k. 氢氧化钠---分析纯。
l. 2 mol/L醋酸钠。
m. 2 mol/L 氢氧化钠---80g/L。
n. 异丙醇-甲醇（1:1，V/V）---200 mL。
o. 5%醋酸---5mL冰醋酸用蒸馏水稀释至100 ml。
p. 25%甲醇---25份甲醇与75份蒸馏水混匀。
q. 0.04 mol/L醋酸钠缓冲液---5.44g醋酸钠用水稀释至1L。
r. 标准溶液配制。
(1)贮备液
称取20 mg玉米赤霉醇及其内标物和10 mg DES及其内标分别置于4个100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得玉米赤霉醇（200 μg/mL）, 玉米赤霉醇内标（200 μg/mL），DES （100 g/mL），DES内标（100 μg/mL）。储存于0oC以下（可保存6个月）。
(2)工作标准液
取上述储备液各100 μL于4个100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到DES，D8-DES为0.1 ng/μL,ZER; ZER，ZER内标为0.2 ng/μL。储存于0oC以下，使用前液温平衡至室温。
s.缀合的DES标准配制
(1)储备液
取一安涪瓶DES-MG（相当于1 mg游离的DES），用甲醇稀释溶解，转移至100 mL容量瓶中（相当于游离的DES 0.1ng/μL）。储存于0oC以下。
注意：工作标准液应当月配制。

5.051D 测定

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2008/12/1 7:16:44 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

注意：
(1) 所有组织样品在分析前应冷冻保存。
(2) 一般清洗方法不能彻底洗取离心管的残留物，最好在清洗前所有玻璃器皿浸泡在清洗液中煮沸2小时。

（a）称取5.0 ± 0.1g匀浆的牛肝和牛肉于50 mL聚丙烯离心管中。
（b）分别在待测样和控制样中加入50 μL玉米赤霉醇内标（0.2μg/μL）和50 μL(已烯雌酚内标0.1 ng/mL)(相当于2.0和1.0 ppb)。
（c）用移液管加11 mL 0.04 M醋酸钠缓冲液。
（d）匀浆1 min。
（e）滴加冰醋酸缓冲液调节pH至4.25 - 4.75（边滴边混合并检测pH值，通常5 - 8滴）。
（f）按下表添加玉米赤霉醇（0.2 ng/μL）和DES-MC (0.1 ng/μL),进行标准品线性回归分析。
-------------------------------------------
浓度(ppb) 添加体积
DES 玉米赤霉醇 ( L)
-------------------------------------------
0.00 0.00 0.0
0.50 1.00 25.0
1.00 2.00 50.0
2.00 4.00 100.0
-------------------------------------------
如果DES为0.25 - 0.5 ppb间,添加标准品浓度低一个数量级。
（g）加100 μL –葡糖苷酶至各样品管中(10,000U)。拧紧盖子,快速混匀10秒。
（h）37oC中恒温或水浴16-18小时或过夜。
(i) 恒温结束后,加16.0 mL乙腈于各样品管中,用手或震荡器中摇动5分钟。
（j）在2450g离心5分钟。
注:离心力(g)=1.118 10-5 r (rpm)2
r = 旋转半径,指轴心到管底的距离(cm)
rpm = 每分钟转数
（k）上清液转移至50 mL具螺口盖的离心管中。
注意:转移上清液时有少许悬浮物带入,不影响测定。
（l）加2mL二氯甲烷和8mL正已烷至上清液中。
（m）用手或震荡器摇动1分钟。
（n）在1060g离心2分钟。
（o）用10mL一次性吸管吸取中间液层(乙腈)至干净20mL闪烁瓶中,不要带入其他液层。
（p）加4mL乙腈到剩下的两相的离心管中。
（q）手工摇动1分钟。
（r）在1060g离心2分钟。
（s）按步骤(o)操作,被吸液加入至同一闪烁瓶中。
停止点：此时样品在室温条件下仅可保存1小时。
（t）用Fisher 190 型浓缩器可在60℃条件下，用过滤的空气流或压缩空气将合并的乙腈液缓慢挥发至干或用常规加热器用氮气流在60℃慢慢吹干。
注：必须除去所有乙腈，约需要45-60分钟。
（u）加入2mL异丙醇-甲醇(1:1),快速震荡5分钟使残余物溶解
（v）加入1.5mL 2N氢氧化钠,震荡5-10秒钟。
注意：此时要进行柱净化。
（w）取AS型离子交换小柱,倾去离子床上液体。
（x）将步骤(v)的样液加到柱床中,用1.0mL异丙醇-甲醇润洗样品瓶,一并加入。将小柱嵌在旋转器内侧环中,塑料废液杯和样品回收杯放在旋转器的外侧。
（y）盖上Prep I盖子,选择程序7。用STEP ADVANCE 开关预制过程STEP 2, 按STEP ACTIVATE/HOLD 开关,使仪器开始运行.4分钟后再按 STEP ACTIVATE/HOLD 开关结束运行。打开盖子,将废液杯倒空，放回原处。
（z）在各小柱中加4mL甲醇,重复步骤(y)
aa. 向溶剂槽1,2,3,4中分别加入下面的溶剂:
洗涤剂1: 溶剂槽1中加入18mL蒸馏水,相当于每小柱加1.4mL。
洗涤剂2: 溶剂槽2中加入33mL 5%醋酸,相当于每小柱加2.75mL。
洗涤剂3: 溶剂槽3中加入22mL 25%甲醇,相当于每小柱加1.75mL。
洗脱剂: 溶剂槽4中加入33±3mL甲醇,相当于每小柱加2.75±0.25mL。
注意:甲醇洗脱液体积需要进行调节(±3mL),这样在步骤(cc)最终体积<0.5mL。这一体积可以根据自己实验室和Prep I仪由化验师预先设定。
bb.选择程序7,用STEP ADVANCE开关预置STEP 3。设定挥发温度至55oC(约为设定5),用START开关启动程序。
cc.程序结束后,取下塑料回收杯,用巴氏移液管将甲醇洗脱液(0.1 - 0.5mL)转入到1mL自动进样器的样品瓶中。如果样液超过0.5mL，在预热的电热板上挥发浓缩。用移液管在回收杯中加200μL甲醇润洗，移入至上面样品瓶中，60oC中氮气流下挥发近干，待GC/MS分析。
注：提取液需保存在0℃及0℃以下，不超过2天。
5.051E. GC-MS分析
a. 在测定玉米赤霉醇时，为获得高灵敏度和对待测峰特别是玉米赤霉醇分离度，仪器测定条件需最佳化。下面列出一种可能的最佳化条件。
GC 惠普5890
色谱柱 HP专用12m 0.2mm i.d., 0.33μm交联，100%甲基硅烷.
（16m 0.20mm i.d., 0.5μm柱已在使用）.
进样器无分流进样，最低260oC
载气氦气，30cm/s
源温度 250oC
接口温度 260oC
20oC/min 5oC/min
程序温度 130oC，1min ----------→ 230oC ----------→ 295OC
(如果终了温度是低于285OC的，那么在两次进样间要有足够时间使干组
分全部流出)
MS HP5970A-MSD
离子化模式电子轰击型
电子能量 70eV
MSD自动校正
在上述条件下各组分的保留时间为：
cis DES 7.3
trans DES 8.0
玉米赤霉醇内标 10.3
左环玉米赤霉醇 12.8
组分离子（停留时间=100 ms）
玉米赤霉醇内标 435
玉米赤霉醇 538，523，433，379
D8-DES 420
DES 412，397，383
b. 用10 L乙酸乙酯溶解残渣，加BSTFAHE和2%TMSI采用柱上衍生技术对样品进行衍生化。用注射器吸取2.0μL样液，再吸取等体积的衍生化试剂（针头在插入衍生化试剂之前，用浸有乙酸乙酯的擦镜纸擦干针头）。采用无分流进样，将注射器中全部内容物（4μL）注入进样口中。
5. 051F 计算
a. 从积分报告中读取所选离子的峰面积和峰高
b. 按下面计算离子比：
玉米赤霉醇：523/538；433/538；379/538
DES：397/412；383/412；对于cis和tran DES峰

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