主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之三十九）

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发表于：2008/12/02 07:50:17 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

用改良的四碟法检测新鲜肉中抗菌物质EEC (筛选法)
A Screening Method For the Detection of Antibacterial Substances in Fresh Meat Using A Modified Four Plate Test
(EEC, Screening Methods)
0. 引言
目的：检测肉样品中残留的抗菌物质
该方法按照欧盟关于残留物指令86/469/EEC而研制。
背景：欧盟已经用四碟法对抗菌物质进行了基本控制，该四碟法是由Bogaerts和Wolf于1980年研制的，在此基础上已有几种改良的方法。本实验方法是由法国社会参考实验室开发的，为法国官方所使用。
1. 范围
该方法是仅能检测鲜肉中是否有抗菌物质的残留，而不能鉴定出其为何种抗菌物质。
2. 主题内容
本法是针对检测样品中抗菌物质。
因检测的抗菌物质不同，检测限也不同，将宽度9mm的圆滤纸片浸入30 l标准抗菌物质溶液，当抑菌圈宽度为12mm时，此时的抗菌物质浓度（ g/kg）作为测定该抗菌物质的最佳灵敏度指标，不同的抗菌物质浓度如下：
青霉素类：青霉素G 15 g；氨苄青霉素50 g；氯唑青霉素400 g；羟氨苄青霉素80 g；苯唑青霉素250 g；双氯青霉素200 g。
四环素类：土霉素250 g；四环素200 g；金霉素30 g。
大环内酯类：螺旋霉素130 g；红霉素30 g；泰乐霉素250 g。
氨基糖甙类：双氢链霉素400 g；庆大霉素100 g。
磺胺类：均不敏感。
喹诺酮类：呋喃坦丁350 g。
氯霉素类：氯霉素8000 g。
（源于CM 90/01Rev.1）
3. 参考文献
93/256/EEC委员会决议，规定的检测具有激素活性和甲状腺拮抗活性的残留物质的方法[OJ, № L. 118, 14.4.93. PP 64-74]。
ISO标准 78/2-1982，标准制定第二部分化学分析标准。
Bogaerts Wolf (1980) 鲜肉中检测抗菌物质残留的标准化方法。Fleischwirtschaft 50, 672-673.
4. 定义
按照本方法，四碟琼脂扩散平板中只要有一个判定为残存有抗菌物质，则该肉样品中抗菌物质的残留测定结果为阳性。
5. 方法提要
将对抗菌物质敏感的微生物接种于陪替氏平器的培养基中，将样品的圆片放在已接种的培养基表面，在适宜的温度下进行培养，在含有抗菌物质的滤纸片周围，细菌的生长受到抑制，形成一个抗菌圈。
测试菌：桔草杆菌 pH6.0 pH7.2 pH8.0
藤黄微球菌 pH8.0
当使用桔草杆菌（pH7.2）作为测试菌时，向培养基中加入三甲氧苄氨嘧啶（TMB），将提高肉中磺胺类药物的检测灵敏度，因为前者与磺胺类药物具有协同效应。
6. 测试
注：如本实验所用的试剂（和仪器）来源同下，将能获得较满意的结果，然而非此来源的试剂和仪器也同样适用，所用的试剂级别必须为分析纯或更好的，实验必须用蒸馏水或相同质量的水。
6.1 化学药品
6.1.1 琼脂（Difco）
6.1.2 氯化钠（Merck）
6.1.3 酪蛋白的胰消化物（Difco）
6.1.4 酪蛋白的胰蛋白酶消化物（Biomerieux）
6.1.5 大豆的木瓜蛋白酶消化物（Difco）
6.1.6 牛肉浸膏（Pasteur）
6.1.7 营养琼脂（Pasteur）
6.1.8 葡萄糖（Prolabo）
6.1.9 硫酸锰（MnSO4 H2O）（Prolabo）
6.1.10 三甲氧苄氨嘧啶（TMP）（）
6.1.11 乙酸（Prolabo）
6.1.12 青霉素钠（）
6.1.13 磺胺嘧啶（）
6.1.14 0.1mol.L-1氢氧化钠溶液（Merck）
6.1.15 硫酸二氢链霉素（）
6.1.16 红霉素（）
6.1.17 甲醇（Prolabo）
6.1.18 实验琼脂pH6.0（脱水培养基 Merck）
6.1.19 实验琼脂pH7.2（脱水培养基 Merck）
6.1.20 实验琼脂pH8.0（脱水培养基 Merck）
6.2 溶液
所有溶液除非特别说明均遮光保存于4～6℃条件下，可保存6个月。
6.2.1 蛋白胨盐溶液
酪蛋白胰消化物 1g
氯化钠 8 .5g
蒸馏水 1L 25℃pH7.2 0.1
121℃15分钟灭菌
6.2.2 胰大豆琼脂（T.S.A）（Difco）
酪蛋白胰消化物 15g
酪蛋白胰蛋白酶消化物 5g
氯化钠 5g
琼脂 15g
蒸馏水 1L 25℃pH7.3 0.2
121℃15分钟灭菌
6.2.3 冷冻菌株的培养肉汤
酪蛋白胰蛋白酶消化物 5g
牛肉浸膏 3g
蒸馏水 1L 20℃pH6.8 0.2
121℃15分钟灭菌
6.2.4 Finley Fields 培养基
营养琼脂 15g
葡萄糖 5g
硫酸锰（MnSO4 H2O）30mg
蒸馏水 1L 25℃pH7.0 0.2
121℃15分钟灭菌
6.2.5 三甲氧苄氨基嘧啶（TMP）溶液
TMP 50mg
5%乙酸 5ml
蒸馏水 500ml 在4～6℃条件下可保存2周
用时稀释该溶液（1/20），TMP最终浓度为0.005mg/mL
6.3 标准溶液
6.3.1 青霉素溶液
青霉素G钠盐 100,000单位（大约61mg）
蒸馏水100ml 在4～6℃条件下可保存4天
用时取上述液稀释100倍（1/100），然后再稀释50倍（1/50），使青霉素G最终浓度为0.02单位/mL。
6.3.2 磺胺嘧啶溶液
取相当于50mg活性物质的磺胺嘧啶加入5ml 0.1mol.L-1氢氧化钠溶液中溶解后，加水至50mL，在4～6℃条件下保存不超过2周。
用前稀释该溶液50倍（1/50），使磺胺嘧啶最终浓度为0.02mg/mL。
6.3.3 二氢链霉素溶液
取相当于50mg活性物质的二氢链霉素（约64mg）加水至50mL，在4～6℃条件下可保存一个月。
用前稀释该溶液200倍（1/200），使二氢链霉素最终浓度为5 g.mL.
6.3.4 红霉素溶液
取相当于50mg活性物质的的红霉素（约54mg）加入甲醇3Ml后，加水至50ml，在4～6℃条件下可保存2周。
用前稀释200倍（1/200），然后再稀释20倍（1/20），使红霉素最终浓度为0.25 g/mL.
6.4 测试菌
6.4.1 桔草芽孢杆菌胞子悬液（Merck）8×106～5×107孢子/mL
6.4.2 藤黄微球菌ATCC 9341（Pasteur）

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2008/12/2 7:50:31 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

7. 仪器设备
7.1 培养箱30 1℃和37 1℃
7.2 冰箱-18℃
7.3 冷藏柜4～6℃
7.4 离心机
7.5 水浴箱室温至100℃
7.6 漩涡混合器
7.7 天平（感量0.1mg）
7.8 pH计（精确度0.1pH单位）
7.9 自动加样器10～100 l
7.10 微量移液管头
7.11 软木塞打孔器（8mm直径）
7.12 打孔器磨具
7.13 解剖刀及刀片
7.14 镍铬金属环或Pasteur移液管
7.15 带齿的镊子
7.16 不锈钢托盘
7.17 圆滤纸片（直径6mm）（Durieux）
7.18 塑料的陪替氏平皿（直径90mm）
7.19 有螺纹的玻璃瓶125mL 250mL 500mL
7.20 Roux烧瓶1L
7.21 带刻度的烧杯1L
7.22 带容积刻度的烧瓶20ml 25ml 50ml 100ml 50ml
7.23 玻璃量筒10ml 25ml 50ml
7.24 有螺纹和无螺纹的玻璃管培养试管（16×160mm）
7.25 灭菌的带帽离心管（容积>60mL）
7.26 灭菌的10ml移液管（刻度分值为0.1mL）
7.27 灭菌和未灭菌的5ml移液管（刻度分值为0.1mL）
7.28 灭菌的和未灭菌的2ml移液管（刻度分值为0.02mL或0.05mL）
7.29 灭菌的和未灭菌的1ml移液管（刻度分值为0.01mL）
7.30 玻璃珠（直径3mm）
7.31 带帽的塑料试管（1.5mL）（Eppendorf）
7.32 相差显微镜
8. 抽样和样品处理过程
8.1 样品必须保存原样,按64/433/EEC规定检测肉中的抗菌物质；
8.2 样品的量要满足实验检测和复验的要求；
8.3 取样和包装要有适当的标识；
8.4 包装、保存和运输要保持样品的完整性；
对样品进行处理时要无菌操作，检测的样品要在-18℃条件下保存和运输。
9. 操作步骤
（注：四碟法适用于肉类样品）
9.1 测试菌的制备
9.1.1 桔草芽孢杆菌
9.1.1.1 桔草芽孢杆菌的接种物可以保存2年
使用商售的悬浮液划线接种于2块T.S.A平板，30℃ 16～18h，以用于分离和鉴定桔草芽孢杆菌。取菌落接种于肉汤培养中，30℃ 3～6h，此时正处于对数生长期，将肉汤分装0 .5～1ml带帽的小试管中放入-18℃冰箱，可保存2年
9.1.1.2 制备孢子悬浮液
将商售的孢子悬浮液分三个连续梯度分别接种于T.S.A斜面30℃16～18h（ 24h）后，加入10个玻璃珠和2mL蛋白胨盐溶液，形成菌悬液，将该菌悬液接种于Finley Fields孢子培养基表面（200mL该培养基预先倾入Roux烧瓶中），30℃培养至少5天。通过相差显微镜观察孢子形成情况。视情况可延长培养时间，培养结束后加入玻璃珠和50mL蛋白胨盐溶液，收获孢子悬液。将该悬液离心（4,400g）15min，弃掉上清液和悬浮颗粒，沉淀中加入50mL蛋白胨盐溶液，离心重复上述过程1次，在离心得到的孢子沉淀物中加入30mL蛋白胨盐溶液，加热至70℃35min后，将孢子悬液保存在4℃。
9.1.1.3 孢子悬液的计数
用蛋白胨盐溶液稀释孢子悬液至10-10，接种平板30℃24h计数。
9.1.1.4 实验平板的制备
9.1.1.4.1 pH6.0实验琼脂
取5mL孢子悬液（浓度为5×104/mL）接种于熔化的45℃实验琼脂中，平放至冷却，如此琼脂当天不用，可放入冰箱中保存一周。
9.1.1.4.2 pH 7.2实验琼脂
步骤同9.1.1.4.1，但在熔化的实验琼脂中预先加入三甲氧苄氨基嘧啶（TMP），浓度为1%（v/v），此琼脂放入冰箱中可保存2天。
9.1.1.4.3 pH 8.0实验琼脂
步骤同9.1.1.4.1，此琼脂也可保存一周。
9.1.2 藤黄微球菌
9.1.2.1 用2mL蛋白胨盐溶液再水化冷干的菌株，其他步骤同9 .1.1.1，复苏培养时间至少24h（37 ℃），用于保存的菌株培养时间为3～6h（37℃）。
9.1.2.2 按9.1.1.2方法，将菌悬液接种于T.S.A培养基表面（200mL T.S.A预先倾入Roux烧瓶中），37℃培养至少24小时。培养结束后加入20个玻璃珠和10mL蛋白胨盐溶液，在瓶中稀释至50mL，在4～6℃条件下可保存一个月。
9.1.2.3 菌悬液的计数
稀释至10-10后，接种，37℃24～48h计数。
9.1.2.4 实验平板的制备
将5mL菌悬液（浓度为5×104/mL）加入已熔化45℃的实验琼脂中，水平放置至冷却，此琼脂平板可在冰箱中保存一周。
9.2 样品的制备
使用前几分钟将样品从冰箱中取出，放入不锈钢托盘中，用直径8mm的打孔器取样品，约需2cm长，将打孔器中的样品用解剖刀分割成厚度为2mm的样品圆片，共需8片，用镊子将8片分别放在四块平板（9.1.1.4.1，9.1.1.4.2，9.1.1.4.3和9.1.1.4.4）上，每个平板2片，样品圆片离平板边缘要1cm以上，每个平板最多可放置6片，也就是说，一个平板上可放置三个实验样品。
9.3 弥散实验
9.3.1 用镊子将圆滤纸片放在桔草芽孢杆菌pH6.0琼脂平板（9.1.1.4.1）中央，取10 l青霉素溶液（6.3.1）滴入滤纸片上，放入30℃培养至少18h，结束后，含有标准抗菌物质的滤纸片周围抑菌圈的宽度最小为6mm（从圆纸片边缘至抑菌圈边缘测量）。
9.3.2 方法同9.3.1，培养基为桔草芽孢杆菌pH7.2琼脂（9.1.1.4.2），标准抗菌物质溶液为磺胺嘧啶（6.3.2）。
9.3.3 方法同9.3.1，培养基为桔草芽孢杆菌pH8.0琼脂（9.1.1.4.3），标准抗菌物质溶液二氢链霉素（6.3.3）。
9 .3.4 方法同9.3.1培养基为藤黄微球菌pH8.0琼脂（9.1.2.4），标准抗菌物质溶液为红霉素（6.3.4）。
10. 结果的判定
如果肉中含有抗菌物质的残留，样品周围会出现一个透明的圆圈（抑菌圈），至少在一个平板上同一份样品的2个纸片周围抑菌圈宽度至少2mm，则该样品的检验结果视为阳性。
11. 特例
12. 操作说明
对可疑阳性的再试验（如唯一的阳性平板上只有一个抑菌圈），必须确定其作用水平，同样当确认某方法时也需采取同样的措施。
13. 质量控制
14. 实验报告
15. 缩略语表（略）
16. 检验流程图
冷冻肉→打孔取样→ 8份圆片样品→2片/平板（4个平板）→培养→观察结果→结论报告

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