主题：【转帖】常见致病微生物的检测

肉毒梭菌及其检验


一、肉毒梭菌

1、生物学状性

　　肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，具有该菌的基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽胞，芽胞比繁殖体宽，呈梭状，新鲜培养基的革兰氏染色为阳性，产生剧烈细菌外毒素，即肉毒毒素。

　　肉毒梭菌为多形态细菌，约为4×1μm的大杆菌，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，位于次极端，或偶有位于中央，常见很多游离芽胞。有时形成长丝状或链状，有时能见到舟形、带把柄的柠檬形、蛇样线装、染色较深的球茎状，这些属于退化型。当菌体开始形成芽胞时，常常伴随着自溶现象，可见到阴影形。

　　肉毒梭菌具有4-8根周毛性鞭毛，运动迟缓；没有荚膜。

　　在固体培养基表面上，形成不正圆形，大约3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界线不明显，向外扩散，呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。在血平板上，出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。在乳糖卵黄牛奶平板上，菌落下培养基为乳浊，菌落表面及周围形成彩虹薄层，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，菌落周围出现透明环。

　　肉毒梭菌发育最适温度为25-35℃，培养基的最适的酸硷度为pH6.0-8.2。

2、肉毒梭菌的致病性

　　肉毒梭菌的致病性在于所产生的神经毒素即肉毒毒素，这些毒素能引起人和动物的肉毒中毒，根据肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C（1、2）、D、E、F、G等七个型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。C、D二型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌极少分离，未见G型菌引起人群的中毒报道。

3、流行病学

　　肉毒梭菌广泛存在于自然界，引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要以发酵食品有关，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等。其它也引起中毒的食品还有：熏制未去内脏的鱼、填馅茄子、油浸大蒜、、烤土豆、炒洋葱、蜂蜜制品等。

　　肉毒梭菌是致死性最高的病原体之一。感染剂量极低，每个人都易感。摄食18-36小时后发病为典型病症，但不典型的可在4小时至8天不等。症状为虚弱、眩晕、伴随视觉成双、渐进性说话障碍、呼吸和吞咽困难。也许会出现腹胀和便秘。毒素最终引起麻痹，呈渐进对称性、自上到下

　　肉毒梭菌在自然界的分布上具有某种区域性差异，显示出生态上的差别倾向。A、B型的分布最广其芽胞广泛分布于自然界，各大洲的许多国家均有检出，；C、D型的芽胞一般多存在于动物的尸体中，或在腐尸附近的土壤中；E型菌及其芽胞存在于海洋的沉积物、水产品的肠道内，E型菌及其芽胞适应于深水的低温，使E型菌在海洋地区的广泛分布。但是，越来越多的调查结果表明，除G型菌之外，其它各型菌的分布都是相当广泛的。

二、肉毒毒素

1、生物学性状

　　肉毒梭菌的致病性在于其产生的神经麻痹毒素，即肉毒毒素，而细菌本身则是一种腐生菌。各个型的肉毒梭菌分别产生相应的毒素，所以，肉毒毒素也分为A、B、C、D、E、F、G等七个型。C型包括C1、 C2二个亚型。

　　A型毒素经60℃2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、E二型毒素要经70℃2分钟才能被破坏；C、D二型毒素对热的抵抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才能完全破坏，不论如何，只要煮沸1分钟或75℃加热5-10分钟，毒素都能被完全破坏

　　肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。

2、致病性

　　肉毒毒素的毒性极强，是最强的神经麻痹毒素之一，据称，精制毒素1微克的毒力为200，000小白鼠（20克）致死量，也就是说，1克毒素能杀死400万吨小白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。

3、流行病学

　　肉毒中毒是由于误食含有肉毒毒素的食品而引起的纯粹的细菌毒素食物中毒。人的肉毒中毒发生并不多，但是发病急、病程发展快、病死率高。肉毒中毒是毒素中毒，潜伏期较短，一般为6至36小时，最长60小时。主要症状有：视力减弱、全身无力、伸舌和张口困难、抬头费力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。

　　据统计，1899年至1990年，在美国共有2305人中毒，经检测，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人感染E型毒素，2人感染F型毒素，有2起中毒事件是由A、B二种毒素引起。F、G二种毒素，主要引起动物肉毒中毒，尚未深入得到研究。

　　重症患者，如果不及时治疗和抗毒素特异治疗，多在2至4天死亡。肉毒梭菌生长和产毒的最适温度是25至30℃，而在人的体温条件下细菌表现为丝状，几乎不能产毒、芽胞也不会发芽。

　　肉毒中毒一年四季均可发生，发病主要与饮食习惯有着密切关系。欧美国家主要的中毒是由于肉类食品、罐头食品引起；日本等沿海国家主要的中毒是由于进食水产品引起；我国内地的中毒主要是由于进食发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）引起的。

三、肉毒毒素检出及肉毒梭菌检验

A、肉毒毒素的检出

　　肉毒中毒的诊断，重要的是毒素的检出及定型；罐头食品的细菌学检验，有时需要证实肉毒梭菌的存在，不过，最终还是要根据产毒试验来鉴定细菌及其型别。

B、肉毒毒素检测的主要程序

1.初步的定性试验----小白鼠腹腔注射法

　　检验样品经适当处理后取上清夜，用明胶磷酸缓冲液稀释（1：5、1：10、1：100三个稀释度）后各取0.5毫升腹腔注射小白鼠；另取上清夜100℃10分钟加热后注射小白鼠；另取上清夜经胰酶处理后注射小白鼠；每个注射样注射二只小白鼠；注射后，定时观察小白鼠，连续观测48小时；排除24小时后死亡的白鼠和无症状死亡的小白鼠；48小时后，如果除了经热处理后再注射样品的小白鼠未死亡，其余小白鼠均死亡的情况，重复试验，增加稀释倍数，计算最底致死量。并进行抗毒素中和试验。

2.中和试验

　　用无菌生理盐水溶解冻干的抗毒素，，取A、B、E、F四种抗毒素注射于小白鼠体内；同时取未注射抗毒素的小白鼠做对照；注射抗毒素30分钟或1小时后，注射不同稀释度（覆盖10、100、1000倍最小致死量）的含毒素样品，观察48小时，如发现毒素未被中和，再取C、D型抗毒素和A-F多价抗毒素重复上述试验；如小白鼠死亡，应将含毒素样品稀释后再重复以上试验。

3．试验的几个注意事项

3.1典型的肉毒中毒，小白鼠会在4至6小时内死亡，而且98-99%的小白鼠会在12小时内死亡，因此，试验前24小时内的观察是非常重要的。

3.2 24小时后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。

3.3如果小白鼠注射经1：2或1：5倍数稀释的样品后死亡，但注射更高稀释度的样品后未死亡，这也是非常可疑的现象，一般为非特异性死亡。

3.4小白鼠要用不会抹去的颜料加以标记。

3.5小白鼠的饲料与水必须及时添加、充分供应。

4.结果分析

4.1食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中毒。

4.2检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒中毒。

4.3肉毒中毒的诊断必须以检出食物中的肉毒毒素为准。

4.4中和试验可以为毒素定型。

C、肉毒梭菌的检验与分离鉴定

　　肉毒梭菌检验方法的重点乃是产毒及毒素的检出试验，如要证实是否有肉毒梭菌存在，只要分离、培养、毒素鉴定即可。

1.前增菌

　　样品分别接种于疱肉培养基、TPGYT培养基，并分别与35、26℃培养7天。

2.分离

　　培养7天后，染色、镜检，观察菌的形态是否为典型的肉毒梭菌。取1-2毫升培养物加等量的酒精混合（或80℃加热10分钟，）后在室问温下培养1小时，非蛋白分解型的肉毒梭菌，因其芽胞不耐热，不要采取热处理的方法。

　　用接种环涂划酒精处理液或热处理的培养物于小牛肝卵黄琼脂或厌氧卵黄琼脂平板上，厌氧培养48小时，35℃。

　　典型菌落是隆起或扁平，光滑或粗糙，在卵黄培养基上用斜光检验时菌落表面通常出现虹晕色（iridescence）,此光区称为“珍珠层”，C、D、E型菌通常有2-4毫米黄色沉淀区围绕，A、B型菌通常显示较小的沉淀区。

　　挑取10个典型菌落，分别接种于疱肉培养基、TPGYT培养基，并分别与35、26℃培养7天，再取培养物按照1.2.1、1.2.2的方法进行肉毒毒素的检测即可。

　　生化反应试验，可以为鉴定做参考，以上肉毒梭菌的培养、分离、鉴定试验力求迅速，不要长时间接触空气，最好在厌氧条件下操作。

四、控制：

　　最根本的预防方法是加强食品卫生管理，改进食品的加工、调制及储存方法，改善饮食习惯，对某些水产品的加工可采取事先取内脏，并通过保持盐水浓度为10%的腌制方法，并使水活度低于0.85或pH为4.6以下，以及对于在常温储存的真空包装食品采取高压杀菌等措施，以确保抑制肉毒梭菌产生毒素，杜绝肉毒中毒病例的发生。

亚硫酸盐还原菌及检测


一、生物学特性与卫生学意义

　　亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌是梭状芽胞杆菌属的一群细菌，而不是一个生物学分类单位。多指厌氧芽胞杆菌，代表性菌株是致黑梭状芽胞杆菌，其他常见的还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌等。此类细菌的主要特征是将亚硫酸盐还原为硫化物，多为有动力的革兰氏阳性菌，可形成芽胞，厌氧生长。

　　厌氧亚硫酸盐还原菌的孢子在自然环境中广泛存在，通常出现在人和动物的粪便排泄物，废水和土壤中。与大肠杆菌和其它杆菌不同的是，由于它们的孢子比营养体对物理和化学因子具有更强的抵抗力，所以可以在自然环境中存活很大时间。因而，通常将他们作为长期污染或间断污染的指示菌。它们甚至可以抵抗正常水处理所用氯的工作浓度，因此，它们对判断是否已达到控制目的非常有用。

　　由于此类细菌抵抗力强，即使在经适当加工处理的加工食品中其芽胞仍会存活，条件适宜时又会生长繁殖，造成食品品质降低或腐败，甚至会引起食物中毒的危险。因此在食品的制备、贮存以及食品加工厂环境卫生控制上颇受重视，作为食品、矿泉水、加工设备卫生、生产环境的卫生状况的评估指标，正确得到越来越广泛的应用。

　　该类细菌的检测多用于环境水质和生活饮用水污染状况的评估，在九十年代中后期开始在食品卫生领域中有所要求，但多局限于欧洲国家和地区，如法国、瑞士、英国、捷克等欧盟成员国。到目前为止，该菌一般不被作为食品卫生常规检测项目和致病菌检测内容，我国和美国未将该检测项目列入食品微生物检测项目和要求中。

二、检测方法

　　由于此类细菌以形成芽胞、厌氧生长和还原亚硫酸盐为硫化氢为主要特征，往往无需作进一步实验验证，因此在检测中将满足以上三个条件的一群细菌全部认定为厌氧亚硫酸盐还原菌。

　　检测方法一般包括以下三部分：检样在接种前在80-100℃水浴中处理10-15分钟，以杀灭抵抗力弱的芽胞细菌的营养体，同时刺激芽胞的繁殖；通过选择性培养如亚硫酸铁盐琼脂等判定是否具有还原亚硫酸盐的能力，如果有则进一步与培养基中的亚铁盐如枸橼酸铁反应，使菌落呈现黑色；培养基接种后置于厌氧环境中培养确认厌氧特征。也可在培养基中加入抗生素等抑制剂抑制其它非亚硫酸盐还原菌的生长。

　　下面详细介绍亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌的检验方法。

1.培养基和试剂

1.1 氯化钠胰蛋白胨稀释液

1.2 亚硫酸铁琼脂

1.3 过氧化氢试剂

2.仪器和设备

2.1 均质器:用于处理固体样品

2.2培养罐（箱）,带产生厌氧环境的设备或试剂

2.3 恒温培养箱:37±1℃或46±1℃

2.4 振荡器

2.5 吸管:1mL、10mL,具0.1mL刻度

2.6 培养皿:直径为90mm

2.7 稀释瓶:容量为500mL和250mL的广口瓶

2.8 天平:感量0.1g

3.抽样和试样制备

3.1 抽样

　　参照SN0330-94规定抽样

3.2试样制备

　　无菌操作称取剪碎后的样品25g,置于装有225mL氯化钠胰蛋白胨稀释液的广口瓶中。若检测亚硫酸盐还原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min热处理样品,之后以流水迅速冷却至室温后再称取。充分混匀后据样品污染情况做进一步的系列十倍梯度稀释。

4.检验步骤与计数

4.1菌落计数法

　　适用于检查未经加工处理的生鲜食品及亚硫酸盐还原梭菌计数>10g(mL)的食品。

4.1.1接种和培养

4.1.1.1对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取1 mL，一式双份地接种于每个灭菌的培养皿中。

4.1.1.2 倾注约15 mL制备好的并于水浴箱保温至45℃的亚硫酸铁琼脂。从制备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个平皿所用的时间不应超过15min。仔细将接种物和培养基充分混匀，水平放置，使其凝固。

4.1.1.3待混合物凝固后，在倾注10 mL同样的培养基于已凝固的培养基上作为隔层以防氧吸附，并防止细菌蔓延生长。

4.1.1.4 待该隔层凝固后反转制备好的平板，于37±1℃厌氧培养24-48h。若对培养温度有特殊要求（如46℃），可依据情况进行培养。

4.1.2计数

4.1.2.1亚硫酸盐还原梭菌在亚硫酸铁琼脂上呈暗灰色或黑色菌落。37±1℃厌氧培养24h后，计数典型的菌落；若平板上无特征性菌落或菌落较小（<0.5mm），则需继续培养24h再计数；若48 h后的菌落增大以至相连，则以24 h的计数为准，反之则以48h为准。

　　那些仅产生氢（而不是H2S）的厌氧菌生长时也可还原亚硫酸盐而导致培养基出现弥散的、非典型的普遍变黑，这种现象不应计数。

4.1.2.2取特征性菌落（不少于5个）移种于疱肉培养基中，37±1℃厌氧培养24-72 h。待出现生长特征（培养液浑浊、产气、出现异味）后，按5条进行证实试验。对阳性结果进行计数。

4.1.2.3读取带有10-100个黑色菌落的平皿，结果以相应稀释度的两个平板的菌落数平均值乘以相应稀释倍数来计算每克样品中亚硫酸盐还原梭菌数。结果报告如下：估计亚硫酸盐还原梭菌数/g(mL)。

　　若相应测试试样的两个平板上均无特征性菌落，以<10/g(mL)报告

4.2最近似值（MPN）法

　　适用于检查亚硫酸盐还原梭菌计数≤10 g(mL)及含有受损伤的亚硫酸盐还原梭菌的加工食品。

4.2.1接种和培养

4.2.1.1增菌

　　选用适宜的三个连续稀释的样液，从每个样液中分别吸取1mL，一式三份地接种于3管装有疱肉培养基的试管中,接种后上面覆盖一层无菌的液体石蜡，37±1℃培养24-72h。待出现生长特征（培养液混浊、产气、出现异味）后,按5.1条进行镜检。反之，则报告阴性。

4.2.1.2分离培养

　　取4.2.1.1增菌培养物1mL置于灭菌的培养皿中，倾注约15mL45℃的亚硫酸铁琼脂。仔细将接种物和培养基充分混匀，待其凝固后，再倾注10mL同样的培养基作为隔层，于37±1℃厌氧培养24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落，按5条加以证实；反之，则报告阴性。

4.2.2结果计算

4.2.2.1计数每个稀释度得到的阳性反应管数。

4.2.2.2利用MPN表，由阳性管数估算每克（毫升）试样中亚硫酸盐还原梭菌最近似值。结果报告如下：估计亚硫酸盐还原梭菌数/g(mL)。

5.证实试验

5.1形态观察

　　取疱肉培养物涂片，镜检，作革兰氏染色，检查培养物细菌形态。亚硫酸盐还原梭菌为革兰氏阳性杆菌，单个散在，成对、成小链状或并列地聚堆存在。产芽胞时，芽胞呈卵圆形或球形，位于中央、次终端或终端。

5.2过氧化氢酶试验

　　在洁净载玻片上滴1滴培养物，再滴加1-2 滴3% 的过氧化氢。

　　出现小气泡说明有过氧化氢酶活性。

　　亚硫酸盐还原梭菌不形成过氧化氢酶。

附录：

A1 氯化钠胰蛋白胨稀释液

　　将8.5g氯化钠和1.0g胰蛋白胨溶解于1000 mL蒸馏水中。调节pH至7.2±0.1。分装225 mL于250 mL广口瓶中，121℃高压灭菌15min。

A2 亚硫酸铁琼脂

　　胰蛋白胨 15.0g

　　大豆蛋白胨 5.0g

　　酵母浸膏 5.0g

　　偏重亚硫酸钠 1.0g

　　柠檬酸铁铵 1.0g

　　琼脂 20.0g

　　蒸馏水 1000g

　　将各成分混匀，加热溶解，调节pH至7.6±0.1，分装于500 mL锥形瓶中各250 mL，121℃高压灭菌15 min。一周内用完。

A3疱肉培养基

　　牛肉浸液 1000 mL

　　蛋白胨 30.0g

　　酵母浸膏 5.0g

　　磷酸二氢钠 5.0g

　　葡萄糖 3.0g

　　可溶性淀粉 2.0g

　　碎肉渣 适量

　　取碎肉渣分装15mm×150mm试管约2-3cm高，将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约1 cm。121℃高压灭菌15 min。

A4 过氧化氢酶试验

　　挑取培养物一接种环，置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液（临用时配制）2mL，于半分钟内观察发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

蜡样芽胞杆菌及检验


　　在《Bergey氏鉴定细菌学手册》第8版中，蜡样芽胞杆菌的分类地位为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。

　　1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。

一、生物学特性

1、形态特性

　　蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力。

2、培养特性

　　蜡样芽胞杆菌生长温度为25-37℃，最佳温度30-32℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状。偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。在甘露醇��卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。

3、生化特性

表1：蜡杆芽胞杆菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别

特 性
蜡样芽胞杆 菌
苏云金

杆 菌
蕈状芽胞杆 菌
炭 疽

杆 菌
巨大芽胞杆 菌

革兰氏染色
+a
+
+
+
+

过氧化氢酶
+
+
+
+
+

动 力
+/-b
+/-
-c
-
+/-

硝酸盐还原
+
+/-
+
+
-d

分介酪氨酸
+
+
+/-
-d
+/-

抗溶菌酶
+
+
+
+
-

卵黄反应
+
+
+
+
-

厌氧利用葡萄糖
+
+
+
+
-

VP反应
+
+
+
+
-

甘露醇产酸
-
-
-
-
+

溶血（羊红细胞）
+
+
+
-d
-

已知致病特性
产肠毒素
晶体内毒素对昆虫致病
根状生长
人畜共患



a+，90-100% 菌株是阳性；

b+/-，50-50% 菌株是阳性；

c-， 90-100% 菌株是阴性；

d-，绝大多数菌株是阴性。


4、耐热性

　　蜡杆芽胞杆菌耐热，其37℃16小时的肉汤培养物的D80℃值（在80℃时使细菌数减少90%所需的时间）约为10-15分钟；使肉汤中细菌（2.4×107/mL）转为阴性需100℃20分钟。其游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需120℃60分钟才能杀死。

二、流行病学

1、细菌分布

　　蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。

　　在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。

2、流行情况

　　蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。

　　蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。1985年9月，美国缅因州的健康局报导了在一家日本餐馆发生了食物中毒而导致的胃肠炎事件，经调查所有的食品其加工和储藏都是规范的，仅用剩饭制作的炒饭其是冷藏储放还是在室温放置说不清楚，在炒饭中虽然找不到活的蜡样芽胞杆菌，但是完全可能存在重新加热过程中消除了活菌而没有破坏热稳定毒素的可能性。

3、临床症状

　　当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。

　　蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。

三、致病性

　　蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。

　　致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0×103。致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。


表2：蜡样芽胞杆菌腹泻和呕吐毒素的性状

性 状
腹泻毒素
呕吐毒素

分子量
55-6.0×103
<5000

稳定性
56℃ 5分钟、pH3或11

毒性消失
115℃10分钟、pH2或11.2小时

毒性残存

活 性
致猴腹泻

对胰蛋白酶敏感
致猴呕吐

对胃蛋白酶、胰蛋白酶耐受

抗原性
特异性抗体中和试验阳性
无抗原性



四、检验和控制

A、样品制备

　　无菌操作称取样品50g放入灭菌搅拌缸内。加Butterfield�s磷酸盐缓冲稀释液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均质2min。用上述1:10稀释液，连续稀释供蜡样芽胞杆菌计数。

B、蜡样芽胞杆菌平板计数

　　移取10mL均质样液（1:10稀释）加到90mL空白液中，从10-2到10-6制备一系列稀释液，充分混匀，并继续稀释直到10-6为止。取样品的各个稀释液（包括1:10）0.1mL接种2只MYP（甘露醇一卵黄多粘菌素琼脂）平板，用灭菌玻璃棒在每只平板表面涂布均匀。将平板置30℃培养24小时，并检查菌落周围有沉淀圈者，表示产生卵磷脂酶。蜡样芽胞杆菌菌落通常是粉红色，随着培养时间的延长则更明显。如果上述反应不清晰，应将平板再培养24小时后计数，从MYP平板上挑取典型菌落5个或更多，移种到营养琼脂斜面上供蜡样芽胞杆菌证实试验用。

C、蜡样芽胞杆菌的最大近似数

　　MPN技术被推荐用于食品中低于10个/g蜡样芽胞杆菌的检验。某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。

　　在胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中接种3管MPN系列，10-1、10-2、10-3的稀释液各接种1mL于3管。将培养管置30℃培养48±2小时，检查生长密集、典型的蜡样芽胞杆菌。将阳性管培养物划线接种于MYP平板，于30℃培养24-48小时。以下步骤同B。

D、蜡样芽胞杆菌的证实试验

　　从MYP琼脂平板上挑取5个或更多的伊红粉色，卵磷脂酶阳性的菌落，移种到营养琼脂斜面上，置30℃培养24小时。取培养物作了革兰氏染色和显微镜观察。再用3mm直径的接种环取培养物到装有0.5mL灭菌磷酸缓冲稀释液的13×100mm试管中，充分混悬均匀。用于下列试验。

·酚红葡萄糖肉汤

·硝酸盐肉汤

·改良的V-P培养基

·酪氨酸琼脂

·溶菌酶肉汤

·MYP琼脂

　　蜡样芽胞杆菌的分离物应符合下述条件。

1)革兰氏阳性产芽胞大杆菌，其芽胞不突出体外；

2）在MYP琼脂上产生卵磷脂酶而不发酵甘露醇；

3）厌氧培养生长，发酵葡萄糖产酸；

4）还原硝酸盐；

5）VP阳性；

6）分介L-酪氨酸；

7）在含0.001%溶菌酶的培养基中能生长。

E、蜡样芽胞杆菌群的鉴别试验

　　从表1可见D部分所述的生化特性为蜡样芽胞杆菌群所共有。要鉴别典型蜡样芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌群的其它种还需进一步进行下述试验。

·动力试验

·根状生长试验

·溶菌活性试验

·蛋白质毒素结晶试验

　　蜡样芽胞杆菌具有动力、强溶血、不形成根状菌落，或不产生蛋白质毒素结晶。

蜡样芽胞杆菌在4℃、pH4.3、盐浓度18%的条件下仍能存活或生长。

通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。

耶尔森氏菌及检验


　　耶尔森氏菌属包括11个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。鼠疫耶尔森氏菌引起黑疽病，不通过食品传染。

　　1981年根据DNA以及生化和形态特征的相关资料，与小肠结肠炎耶尔森氏菌极为密切3个同源群被作为耶尔森氏菌的新种命名，它们是弗氏耶尔森氏菌（Y·frederiksenii）、中间型耶尔森氏菌（Y·intermedia）和克氏耶尔森氏菌（Y·krislensenii）。

一、生物学特性

1、形态特性

　　本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为1-3.5×0.5-1.3μm，多单个散在，有时排列成短链或成堆。本菌不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛；但其鞭毛在30℃以下培养条件形成，温度较高时即丧失，因此表现为30℃以下有动力，而35℃以上则无动力。

2、培养特性

　　本菌生长温度为30-37℃，但在22-29℃才能使本菌的某些特性出现。4℃时能保存和繁殖。本菌世代时间长，最短亦需40分钟左右。在SS或麦康凯琼脂上于25℃经24小时培养，菌落细小，至48小时直径才增大成0.5-3.0mm。菌落圆整、光滑、湿润、扁平或稍隆起，透明或半透明；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色，如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深。本菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。

3、生化特性

表一：本菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别

反 应
鼠 疫

耶氏菌
假结核耶氏菌
小肠结肠炎耶氏菌
中间型耶氏菌
费 氏

耶氏菌
克 氏

耶氏菌

赖氨酸
-
-
-
-
-
-

精氨酸
-
-
-
-
-
-

鸟氨酸
-
-
+
+
+
+

动力(22-26℃)
-
+
+
+
+
+

动力(35-37℃)
-
-
-
-
-
-

尿 素
-
+
+
+
+
+

苯丙氨酸

脱氨基酶
-
-
-
-
-
-

甘露醇
+
+
+
+
+
+

山梨醇
+/-
-
+
+
+
+

纤维二糖
-
-
+
+
+
+

核糖醇
-
-
-
-
-
-

肌 醇
-
-
+/-
+/-
+/-
+/-

蔗 糖
-
-
+
+
+
-

鼠李糖
-
+
-
+
+
-

棉子糖
-
+/-
-
+
-
-

蜜二糖
-
+/-
-
+
-
-

枸橼酸盐
-
-
-
+/-
+/-
-

V-P
-
-
+/-
+
+
-

吲 哚
-
-
+/-
+
+
+/-

水杨甙
+/-
+/-
+/-
+
+
-/+

七叶甙
+
+
+/-
+
+
-

脂 酶
-
-
+/-
+/-
+/-
+/-

吡嗪酰胺酶
-
-
+/-
+
+
+


4、生物型

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型分类方法有几种，目前FDA细菌分析手册第八版中采用的是Wanters 1981的分型方法。


表二：小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型

生化测试
生 物 型 反 应

1A
1B
2
3
4
5
6

脂 酶
+
+
-
-
-
-
-

七叶甙/水杨甙

(24h)
+/-
-
-
-
-
-
-

吲 哚
+
+
(+)
-
-
-
-

木 糖
+
+
+
+
-
V
+

海藻糖
+
+
+
+
+
-
+

吡嗪酰胺酶
+
-
-
-
-
-
+

β-D葡糖甙酶
+
-
-
-
-
-
-

V-P
+
+
+
+/-c
+
(+)
-


注：( ) 表示迟缓反应

V 表示可变反应

C 在日本发现血清型为0:3的生物型

5、血清型

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株根据其耐热性和耐受高压灭菌的菌体抗原能被血清学分型。Wanters将小肠结肠炎耶尔森氏菌和相关菌归纳为54个血清群，Aleksii和Bockemuh等人提议将小肠耶氏菌的血清群简化为18个群。目前下列血清群的致病菌株已通过鉴定，它们是0:1,2a,3；0:2a,3；0:3；0:8；0:9；0:4,32；0:5,27；0:12,25；0:13a,13b;0:19；0:20；0:21。引起人类疾病的主要血清群是0:3,0:8,0:9和0:5,27。

二、流行病学

1、细菌分布

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌分布很广，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、哈和虾。也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。已从家畜、狗、猫、山羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中分离出该菌。在港湾周围，许多鸟类包括水禽和海鸥可能是带菌者。

　　猪的带菌率较高，日本报告检出率为4%，加拿大为3.6%，丹麦为10-17%。在猪中，该菌最易在扁桃腺中发现。

2、流行情况

　　确定耶尔森氏菌作为一种食源性疾病的有关特性了解较多，其在世界范围内已爆发多起，食品和饮水受到污染，往往是爆发胃肠炎的重要原因。七十年代在加拿大魁北克地区暴发过两起，有138名儿童感染，源于摄入生牛奶。1976年在美国纽约爆发过一起，有217名学生感染，在这起发病过程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。1980年发生于华盛顿的一起有87人感染，污染源是用未经氯处理的泉水做的豆腐。由本菌引起的胃肠炎或中毒爆发，在欧洲以冬春季节较多，夏季较少，而日本则以夏季发病率较高。在我国福建省南部地区，该菌是冬春季腹泻的重要病原菌，根据陈元川案（1984）于不同季节对猪带菌动态的调查，发现两个养猪场仅在冬春两季有该菌检出，检出的菌株均为O3血清型。

3、临床症状

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌是30年代引起注意的急性胃肠炎型食物中毒的病原菌，为人畜共患病。潜伏期约摄食后3-7天，也有报导11天才发病。病程一般为1-3天，但有些病例持续5-14天或更长。主要症状表现为发热、腹痛、腹泻、呕吐、关节炎、败血症等。耶尔森氏菌病典型症状常为胃肠炎症状、发热、亦可引起阑尾炎。有的引起反应性关节炎，另一个并发症是败血症，即血液系统感染，尽管较少见，但死亡率较高。

　　本菌对易染人群为婴幼儿，常引起发热、腹痛和带血的腹泻。

三、致病性

1、肠毒素

　　该菌能产生耐热性肠毒素，（分子量为10000-50000），能耐热121℃30分钟，能在4℃保存7个月，pH1-11中稳定。但肠毒素的产生仅限于22-25℃。血清型03、08和09几乎经常产生肠毒素，在其他血清型中也有产生肠毒素的菌株。该肠毒素被摄入即可引起发病。

2、侵袭性

　　Hela细胞感染，血清型O1、O3、O4、O5B、O8、O9、O15、O18、O20、O21和O22都能侵入Hela细胞，鉴于Hela细胞感染阳性株多是人类致病的常见血清型，以及从人和动物死亡所见肠类的侵入模型，表明Hela细胞侵入性在小肠结肠炎耶尔森氏菌腹泻的发病机理上是重要的。

　　Sereny试验，有人将11株小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌悬液接种于豚鼠眼结膜，有6株引起严重的角膜结膜炎，即Sereny试验阳性。这6株均为O8血清型。

3、自凝性。

　　1980年Laird等人提出了一种测定本菌毒力的简易方法，即将试验菌接种于二管含10%小牛血清的组织培养液内，分别置22℃和36+1℃培养，若22℃培养，菌液混浊，而37℃培养，细菌凝结，上层液体透明，即为有毒力的菌株，称为自凝阳性。在检查的180株菌中有25株阳性，这些阳性菌株均能引起腹泻。

4、VW抗原

　　已知该菌的某些菌株具有与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌在免疫学上相同的VW抗原。其在37℃生长时需要钙而在25℃生长时不需要钙的菌株即含VW抗原。Karmali等人将从病人粪便检出的O21血清型自凝阳性的菌株，在草酸镁琼脂上于35℃培养不生长，用于口服小鼠则产生腹泻。可见自凝阳性与缺钙培养基上35℃无生长能力是一致的，能使小鼠发生腹泻。

5、毒性质粒。

　　耶氏菌病和小肠结肠炎耶尔森氏菌带有41-48Mdal的质粒有关。这被认为是毒性质粒，即与毒力有关的质粒。有人将失去毒性质粒的O8、O3和O9型菌株用小鼠作喂饲试验，均不发病，但用带毒性质粒的O8和O3型菌株试验时，小鼠则均发生腹泻或死亡。且菌株自凝试验的结果与毒性质粒的存在与否相一致。

四、检验与控制

A、增菌

　　1、无菌称取25.0g样品于225mL，蛋白胨山梨醇胆汁肉汤（PSBB）中，均质30秒，置10℃培养10天。

　　2、如果怀疑产品为高含量耶氏菌，在肉汤培养前各取0.1mL划线于麦康凯琼脂和cefsulodin�irgasan�新生霉素(CIN)琼脂。然后取1mL均质液至9mL 0.5%盐水(含0.5%KOH)中，混合数秒钟，各取0.1mL 划线麦康凯和CIN琼脂平板。将平板置30℃培养1天，把平板上生长的菌落转移到Whatmam541滤纸上，用于DNA克隆杂交技术直接检测耶氏菌的致病基因。如果耶氏菌含量较低，省去这一步。

　　3、将经10天培养的增菌肉汤充分混合，转移0.1mL至1mL 0.5%盐水（含0.5%KOH）中，混合5-10秒。连续划线于麦康凯平板和CIN平板。另取0.1mL增菌液至1mL 0.5%盐水中，如上在划线前混合5-10秒。置平板于30℃培养1天。

B、细菌分离。

　　检查经1天培养的麦康凯平板，排除红色或粘液状菌落，挑取小的（直径1-2mm），偏平，无色的或淡粉红色菌落。同时检查CIN平板，挑取具有紧红色中心整个边缘明显无色的小菌落（直径1-2mm）。用接种针将所选菌落穿刺接种于赖氨酸精氨酸铁琼脂（LAIA）斜面。Christensen�s尿素琼脂平板或斜面。胆汁七叶甙琼脂平板或斜面。室温培养48小时。在LAIA中的培养物会产生硷性斜面，酸性底层，不产生气体和H2S（KA--）的反应，被认为是尿素酶阳性的可疑耶氏菌。去除在LAIA中产H2S或产气或尿素酶阴性的培养物。

C、鉴定

　　将LAIA斜面上的培养物划线接种于厌氧卵黄琼脂（AEY），置室温培养。使用AEY上的生长物进行纯度检查、脂肪酶反应（2-5天）氧化酶试验、革兰氏染色、和生化试验的接种。将AEY上的菌落接种于生化试验培养基，置室温培养3天（动力试验培养基和MR-VP肉汤在35-37℃培养1天）。

D、解释

　　耶尔森氏菌为氧化酶阴性、革兰氏阴性的杆菌，表1和表2可用于鉴定耶氏菌的菌株和生物型。目前已知小肠结肠炎耶尔森氏菌生物型为1B、2、3、4、5具有致病性，这些生物型和第6生物型以及克氏耶氏菌不能快速水介七叶甙和发酵水杨甙。生物型6和克氏耶氏菌相当少，可以通过微弱发酵蔗糖加以区别，并且吡嗪酰胺酶均为阳性反应。对于生物型1B、2、3、4、5的小肠结肠炎耶氏菌可进一步进行致病性测试。

　　耶尔森氏菌为兼性厌氧菌，生长温度为-1�48℃，能在反复冷冻，缓化下存活。由于该菌可在4℃下进行冷增菌，因此保存在4-5℃冰箱中的食品具有污染的危险。该菌要求较高的水活度，最低水活度为0.95，pH接近中性，较低的耐盐性。对加热、消毒剂敏感。

　　控制耶尔森氏菌的关键因素包括适当的蒸煮或巴氏灭菌，适宜的食品处理以防止二次污染。进行水处理、合理使用消毒剂等控制措施。